このプロトコルは、我々は我々が開発中の新皮質の拡大と折りたたみを研究することを可能にする重要な動物モデルで生体内で遺伝子操作を実行することができます。この方法の主な利点は、脳の発達のための重要な細胞型である神経幹細胞を標的とする上で、高い空間的および時間的特異性を使用することです。手順を開始する前に、マイクロピペットプーラーでガラスの毛細血管を引っ張り、鉗子を使用して毛細血管の遠位部分を切断して毛細管先端の直径を調整します。
胚性33日目に、PBSに適切なDNA濃度を加え、穏やかな混合で0.1%高速グリーンを補い、ヒートパッド付きの手術台に3時間断食した麻酔を受けた妊娠中の女性フェレットを置きます。両後肢の2番目と3番目または3番目または4番目のつま先の間で皮膚をつまんで、適切なレベルの沈澱を確認します。イオブルランは、吐き気やめまいなどの副作用を引き起こす可能性があります。
イオブルランを液体で取り扱う場合は、保護具を使用してください。手術中、適切なキャニスターを使用してガスを捕獲します。動物を鎮痛薬、抗生物質、ブドウ糖で皮下注射し、動物の目に軟膏を置きます。
バリカンを使って腹部を剃り、水、石鹸、ヨウ素溶液で露出した皮膚をきれいにします。その後、ガーゼ綿棒で肌を乾燥させ、アルコールとヨウ素のスクラブで消毒します。子宮内のエレクトロポレーションでは、動物の上に無菌ドレープを置き、メスを使用してリネアアルバで約5センチメートルの皮膚切開を行います。
はさみを使って筋肉層を切り取り、切開部位の周りにガーゼ綿棒を置きます。PBSでガーゼを濡らし、綿棒の上に子宮を置きます。長い先端を持つピペットを使用して、注射する胚あたり5マイクロリットルのDNA溶液で引っ張られたガラス毛細血管の1つをロードする。
装填したキャピラリーをホルダーに取り付け、ホルダーの反対側をチューブとマウスピースに接続します。最初の胚の頭部を見つけ、頭部の隣に光ファイバー光源を置く。色素アイリスを基準点として使用し、ガラス毛細血管の先端を用いて皮膚、頭蓋骨、および脳組織を浸透させ、口腔内で3〜5マイクロリットルの注射液を脳半球の1つの心室に送達するのを容易にする。
注入された溶液は0.1%の速い緑を含んでいるので、正常な注入は、腎臓形の構造として表示されるように、注入された心室の濃い緑色の染色をもたらす。注射後、対象とする領域の上に正極を、注入領域の下に負極を持つ胚の頭の上の子宮の上にツイーザー電極を置きます。エレクトロポレートのパルス長を50ミリ秒、パルス電圧を100ボルト、パルス間隔を1秒、パルス数を5に設定します。
すべてのパラメータが設定されたら、Pulseを押して、すぐに電気ポレート胚に暖かいPBSの数滴をドロップします。すべての胚が電気ポポレートされたら、子宮を腹腔に戻し、4-0縫合糸を使用して腹膜で筋肉層を閉じる。同様の方法で皮膚を閉じ、アルミニウムスプレーで傷口を覆います。
その後、完全な再実行まで熱源と監視でケージに動物を返します。胚性37日目のエレクトロポレーションの4日後、標的細胞とその子孫のほとんどは依然として生殖領域にあり、皮質プレート内でさらに基底観察されることはほとんどありません。前駆体の同一性は、PCNAなどのサイクリング細胞のマーカーに対する免疫蛍光によって調べることができ、一方、有糸分裂を起こしている前駆物質のサブセットは、ホスホヒストン3などのマーカーによって示すことができる。
出生後ゼロでは、エレクトロポレーションの8日後に、標的細胞の子孫がすべての組織学的層に広がった。転写因子マーカーの組み合わせを用いて、異なる基底前駆物質集団が明らかにすることができる。例えば、Sox2は、基底径グリアを含む増殖前駆細胞のマーカーである。
Tボックス脳タンパク質2は、主に中間前駆物質である神経原性基底前駆体のマーカーである。出生後16日目までに、標的細胞の大部分が分裂を停止し、ニューロンおよびグリアに分化し、フェレット出生後16日目の新皮質が特徴的な折りたたみパターンを示す。フェレット胚の子宮内エレクトロポレーションは、遺伝子の機能を研究するための非常に強力な方法です。
ヒト特異的遺伝子を含む新皮質の進化の拡大に関与している遺伝子を研究することができました。そして、この強力な方法を使用して、我々は確かに人間の新皮質の進化的拡大がどのように働いたかの重要な特徴を見つけることができました。
