Bu protokol bize gelişmekte olan bir neokorteks genişleme ve katlama çalışma sağlayan önemli bir hayvan modeli vivo bir genetik manipülasyon gerçekleştirmek için izin verir. Bu yöntemin ana avantajı beyin gelişimi için anahtar hücre tipi olan bu nöral kök hücreleri hedeflemede yüksek mekansal ve zamansal özgüllük kullanarak. İşleme başlamadan önce, bir mikro pipet puller üzerinde cam kılcal damarlar çekin ve kılcal uç çapını ayarlamak için kılcal distal kısmını kesmek için forceps kullanın.
Embriyonik gün 33, PBS DNA uygun konsantrasyonu ekleyin, nazik karıştırma ile% 0.1 Hızlı Yeşil ile takviye, ve bir ısı yastığı ile bir operasyon masasına 3 saatlik açlık, anestezi, hamile kadın gelincik yerleştirin. Perioküler deriye dokunarak ve her iki arka ekstremitenin ikinci ve üçüncü veya üçüncü ve dördüncü ayak parmaklarını arasında deriyi çimdikleyerek uygun sedasyon düzeyini doğrulayın. Isoflurane mide bulantısı ve baş dönmesi de dahil olmak üzere yan etkilere neden olabilir.
Sıvı halde isofluran alırken koruyucu ekipmanı kullanın. Ameliyat sırasında, gaz yakalamak için uygun kutular kullanın. Analjezik, antibiyotik ve glikoz ile hayvan subkutan enjekte ve hayvanın gözlerine merhem yerleştirin.
Karın tıraş ve bir su, sabun ve iyot çözeltisi ile maruz kalan cilt temizlemek için makası kullanın. Daha sonra, gazlı bez bezleri ile cilt kuru ve alkol ve iyot scrubs ile dezenfekte. Rahim elektroporasyonu için, hayvan üzerinde steril bir perde yerleştirin ve linea alba yaklaşık 5 santimetre lik deri kesi yapmak için bir neşter kullanın.
Kas tabakasını kesmek ve kesi bölgesinin etrafına gazlı bez yerleştirmek için makas kullanın. PBS ile gazlı bez ıslak ve bezleri üzerine rahim yerleştirin. Uzun uçlu bir pipet kullanarak, çekilen cam kılcal damarlardan birini embriyo başına 5 mikrolitre DNA çözeltisi ile enjekte edilecek şekilde yükleyin.
Yüklü kılcal damarı bir tutucuya takın ve tutucunun diğer tarafını bir tüpe ve ağızlıklara bağlayın. İlk embriyonun başını bulun ve başın yanına fiber optik ışık kaynağı yerleştirin. Bir referans noktası olarak pigmentli iris kullanarak, cam kılcal ucu ile deri, kafatası ve serebral doku nüfuz ve serebral hemisfer birinin ventrikül içine enjeksiyon çözeltisi 3-5 mikrolitre teslim kolaylaştırmak için ağız pipetleme kullanın.
Enjekte edilen çözelti %0.1 Hızlı Yeşil içerdiğinden, başarılı bir enjeksiyon enjekte edilen ventrikülde koyu yeşil bir lekelenmeyle sonuçlanır ve bu da artık böbrek şeklinde bir yapı olarak görülebilir. Enjeksiyondan sonra, hedeflenecek alanın üzerinde pozitif kutup ve enjekte edilen alanın altında negatif kutup ile embriyo başının üzerinde rahim üzerinde cızırtı lı elektrotlar yerleştirin. Elektroporate'nin darbe uzunluğunu 50 milisaniyeye, darbe gerilimini 100 volta, darbe aralığını bir saniyeye ve darbe sayısını beşe ayarlayın.
Tüm parametreler ayarlandığında, Pulse tuşuna basın ve hızlı bir şekilde elektroporated embriyo üzerine sıcak PBS birkaç damla bırakın. Tüm embriyolar elektroporated zaman, periton boşluğuna rahim dönmek ve periton ile kas tabakası kapatmak için 4-0 sütür kullanın. Benzer bir şekilde cildi kapatın ve alüminyum sprey ile yara kapağı.
Daha sonra bir ısı kaynağı ve tam recumbency kadar izleme ile kafese hayvan dönün. Embriyonik gün 37 elektroporasyon dört gün sonra, hedeflenen hücrelerin çoğu ve bunların dölleri hala germinal bölgelerde ve hücreler nadiren kortikal plaka içinde daha basal gözlenir. Ata kimliği, PCNA gibi bisiklet hücrelerinin belirteçleri için immünororesence tarafından incelenebilirken, mitoz geçiren ataların bir alt kümesi fosfo-histon 3 gibi belirteçlerle gösterilebilir.
Doğum sonrası sıfırda, elektroporasyondan sekiz gün sonra, hedeflenen hücrelerin soyundan gelen ler histolojik katmanların tümüne yayılır. Transkripsiyon faktörü belirteçlerinin bir kombinasyonu kullanılarak, farklı bazal ata popülasyonları ortaya çıkabilir. Örneğin, Sox2 bazal radial glia da dahil olmak üzere proliferatif progenitor hücrelerinin bir belirteçtir.
Ve T-box beyin proteini 2 nörojenik bazal atalarının bir belirtecidir, hangi esas olarak ara ataları vardır. Doğum sonrası gün 16, hedeflenen hücrelerin çoğunluğu bölme durdurmak ve nöronlar ve glia farklılaşmak, gelincik doğum sonrası gün 16 neokorteks karakteristik katlama deseni sergileyen. Gelincik embriyolarının rahim elektroporasyonu genlerin işlevini incelemek için son derece güçlü bir yöntemdir.
Neokorteksin evrimdeki genişlemesine karışan genleri incelememizi sağladı, insana özgü genler de dahil. Ve bu güçlü yöntemi kullanarak, insan neokorteksinin evrimsel genişlemesinin nasıl işe yaradığının temel özelliklerini gerçekten bulabildik.
