著者らはこの手法に関する有用な議論をジョセフLoTurcoとデニスSelkoeに感謝します。著者らはこの研究をサポートするため、アメリカの健康支援基金のドナーに感謝。

子宮内エレクトロポレーションのための基本的なプロトコルはKriegsteinラボ1、2から別のJoveの記事で詳細に記載されている。この手法はもともと大隅研究室3に記載され、我々のプロトコルがLoTurcoラボ4で開発されたものに基づいています。我々は、神経突起伸長における遺伝子機能の研究に子宮内エレクトロポレーションに適用される我々のプロトコルの説明に続いて最も重要な細部、を中心に、ラット胚の子宮内エレクトロポレーションのために我々のプロトコルの概要について説明します。 （1） 子宮内エレクトロポレーションで <ol><li> DNAとローディング針の準備 子宮内エレクトロポレーションのための最初のステップは、DNAを使用すると、注入するコンストラクトを決定するために実験を設計することです。このメソッドは、misexpressingまたは関心のある遺伝子をノックダウンの両方に便利です。あなたがmisexpressingまたは過剰発現する遺伝子を予定している場合は、神経前駆細胞で活性であるプロモーターを使用してください。我々はニワトリβ-アクチンプロモーターとCMVエンハンサー5から構成されてCAGGSプロモーターを、お勧めします。細胞の小さなサブセットのみが子宮内エレクトロポレーションに使用してトランスフェクトされているので、それはあなたが正常に電気穿孔したこれらの細胞に従うことができるようにコードするプラスミドGFPなどの蛍光タンパク質を指定することが重要です。をコードするプラスミドのGFPの場合、我々はマイクロリットルあたり0.5μgの濃度でDNAを調製することをお勧めします。 shRNAコンストラクトの場合は、我々は効率的でμL結果あたり0.5から1.0μG目的遺伝子のノックダウンすることを見出した。過剰発現またはmisexpressionの場合は、我々は遺伝子の大きさと実験のために呼び出すことの発現のレベルに応じて、マイクロリットル当たり1.0〜3.0μgを使用してください。 DNAはキアゲンエンドトキシンフリープレップキットを用いて調製し、1 × PBSで希釈されています。我々は、そう、動物のくずのために我々は注射のためのDNAの混合物の10μLを準備し、胚の脳あたり約0.5から1.0μLを注入する。我々は注入されたDNAをフォローできるように、我々は、DNAにファストグリーンの1μLを加える。 正しい形状に針を引っ張ると、重要なステップです。その後、我々の1,2を Walantus らは DNAを提供するための別のシステムを使用しているので、その針の準備もslighly異なります。あなたの針を引っ張るために使用する設定は、使用している針引き手のブランドに依存するであろう。我々はDavid K​​opfはからモデル750を使用してください。我々が使用する設定は以下の通りです：ヒート1：9.0、ヒート2：0、Soleniod：0、フィラメントの大きさ3.0ミリメートル、ヒーターの近接さ3mm、時間：10秒。一度プル、我々は、開口部の最大の部分から先端までの距離が11 mmであることなど〜45度の角度でかみそりの刃で私たちの針をカット。私たちは、その後、針のバックエンドからDNAをロードする。私たちは、その後、コーン油と針の残りのスペースを埋める。 DNA注入の場合、我々はPicospritzer IIIを使用してください。それぞれの針のためにカットされている正確なベベルに応じて、我々は、4.0から6.0にPicospritzerを設定します。我々は、針からDNAを排出加圧空気を供給するためにフットペダルを使用してください。 </li><li> 手術のために動物を準備 我々はこれらの手術のために独占的に病原体フリーSprague Dawleyラットを使用してください。他のいくつかのラボでは、同様に遺伝子型の異なるマウスを使用してください。ここでは、E15ラット胚のエレクトロポレーションのために我々のプロトコルを示して説明しますが、 子宮内エレクトロポレーションは、日常的にE13とE18の年齢の間にラットで行われます。初期段階のエレクトロポレーションは、大脳皮質の深い層をターゲットにしながら、後の段階のエレクトロポレーションはより多くの表面的な層をターゲットにしています。 手術が始まる前に動物をブプレノルフィン（0.05〜0.1 mg / kg体重）の術前投与が与えられます。動物を麻酔するための複数のオプションがあります。我々が日常的にケタミン（40〜80 mg / kg体重）及びキシラジン（5〜10 mg / kg）を1,2の腹腔内注射を使用している間Walantus らは 、isofuorane吸入を利用しています。つま先のピンチは、常に動物が完全に麻酔して応答しないことを保証するために実行する必要があります。動物は、外科的処置を通して加熱されたパッドの上に保持されます。 動物の毛皮は、切開の地域で剃毛、およびヨウ素との三回に続いてエタノールで3回洗浄する。切開は、筋肉の切開続いて、正中線のちょうど外側の皮膚で作られています。子宮角を非常に慎重に公開されています。彼らは優しく指先を使用して、体腔外にからかわれている。彼らは、体腔外にある間、滅菌PBSで胚が水和してください。 </li><li> 注入DNAとエレクトロポレーション 最初にこれらの手術を行って起動すると、最も難しい部分は、側脳室を埋めるように、DNAを注入する必要がある場所に慣れてきているし、正しい地域をヒットするために、針を注入深に慣れて。あなたがidentをできるように、胚は優しく指先で操作されます頭がどこにあるかify、そしてあなたがよく見ると、正中線縫合糸を見ることができます。これは、側脳室が存在する場所を判断するために使用できる一般的なランドマークとして機能します。我々は、子宮壁を通って側脳室へのDNAを注入する。側脳室がDNA /染料混合物で満たされるまで、DNAの複数のパルスが実行される - 私たちは、DNAの注入を制御するためのフットペダルを使用してください。私たちは、その後、胚の頭部の両側にパドルの電極を配置し、胚の頭部全体にパルスを供給するために別のフットペダルを使用。電極の配置は、電気穿孔さ皮質のどの領域を決定する上で重要です。 DNAは負に帯電しているので、DNAは電荷がパドルを介して払拭され、正極に向かって移動する。電極の正確な配置に応じて、細胞の異なるサブセットがターゲットされます。我々は日常的に大脳全体の背内側の位置に近い正極を配置する。しかし、LoTurcoラボは美しくて、大脳のより腹側方の領域に電極を配置した場合に、皮質-線条体の境界と外側皮質流れ6のヒット細胞の細胞を標的とすることができることを示した。それぞれの胚は、エレクトロポレーションすることができ、DNAの構造の異なる組み合わせは、それぞれの胚で使用することができます。 </li><li> 縫合と術後ケア すべての胚のエレクトロポレーションに続いて、子宮角を慎重に体腔に戻され、筋層と皮膚の両方を縫合されています。この技術はWalantus ら 1,2で説明されています。彼らは麻酔から回復するまで、動物は連続的に監視され、そして鎮痛剤ブプレノルフィン（0.05〜0.1 mg / kgの）ごとに8〜12時間に投与される。 </li></ol> 2。培養は、皮質ニューロンのエレクトロ<ol><li> エレクトロポレーションの脳を収穫し、エレクトロポレーション領域を解剖 子宮内エレクトロポレーションでは、次のin vivoでの解析のために、動物は成人期に出生後早期にエレクトロポレーション後24時間から、いつの時点で収穫することができる。しかし、培養するときの主ニューロン我々は、E16でのエレクトロポレーション後24時間を収穫。この時点では、エレクトロポレーション胚がGFPの検出可能なレベルを表現している。 動物は二酸化炭素の吸入と迅速な断頭を使用して安楽死させる。胚は、胚がどのDNAプラスミドを電気穿孔されたを追跡すること、子宮外切開し、二価カチオンとのHBSSに配置されます。それは、フィルタ処理HBSS、滅菌チューブ、プレート、そして解剖用オートクレーブのツールを使用することが重要です。皮質は、外切開し、髄膜は、ボンネットに顕微鏡を使用して削除されます。これらの皮質は、GFPを視覚化する能力を持つ解剖顕微鏡下で観察されています。大脳皮質のGFP陽性領域には識別されず、我々UE皮質からGFP陽性領域をカットするヴァンナはさみされています。これらの作品は、15 mlコニカルチューブの二価カチオンなくHBSSに配置されます。 </li><li> 神経細胞を解離し、めっき すべてのGFP陽性領域が解剖されると、HBSSは、0.25％トリプシンで置き換え、そして5分間37℃でインキュベートする。トリプシンは、削除メッキの培地（DMEM +5％FBS +ペン/連鎖球菌+グルタミン）、および細胞を解離するために摩砕し、5〜7倍に置き換えられます。使用されるボリュームは、組織の存在量に依存する。解離細胞はその後、CC2コーティングチャンバースライドに播種されています。メッキのメディアの1.5mlの体積の2つのチャンバースライド用、我々は、板室あたり200,000-350,000細胞を。 4時間後、メッキのメディアは、吸引し、チャンバーあたり1.5 mLのニューロン培養培地（Neurobasalメディア+ B27サプリメント+グルタミン+ゲンタマイシン）に置き換えられます。 </li></ol> 3。神経突起の伸長を分析<ol><li> 文化を固定し、免疫染色 これらの細胞の遺伝子操作の短期effecsを測定するために、我々はin vitroで三日後に一次ニューロンを収穫。一次ニューロンは、追加分析のために長く培養する場合は、メディアの半分は3日ごとに交換する必要があります。文化を固定するため、我々は、チャンバーから培地を吸引除去し、15分間、4％paraformaldhydeでニューロンを修正。以下の固定は、細胞をPBSで2回洗浄し、次いでブロッキング溶液（2％ロバ血清0.1％トリトンPBSでX - 100）1時間。に置かれている次いで、細胞を1時間一次抗体でインキュベートする。ベータIIのチューブリンの免疫染色のラベルneruonal細胞体、樹状突起と軸索 - 神経突起伸長の分析については、我々は神経細胞を識別するために、抗βtubululinの抗体を使用してください。その後、細胞を5分間PBSで3回洗浄し、DAPIで核を対比してマウントさらに3つのPBSの洗浄、続いて、1時間のCy3 -抗マウスでインキュベートする。 </li><li> NEの測定uriteの長さ GFP陽性、β- IIIチューブリン陽性ニューロンの画像は、MC100カメラシステムでツァイスのAxioskopに取得されます。いくつかの変数は、すべての神経突起の長さは、最長の神経突起の長さを含めてこれらのGFP陽性細胞で調べることができます、神経突起、細胞体の大きさ、等の分岐を我々は、ノックダウンや遺伝子の過剰発現により神経突起の伸長を分析するためにこのメソッドを使用している神経突起の長さを中心に、神経発達と神経変性に関連。神経突起の伸長を測定するために、我々はAxioVisionのLE 4.4ソフトウェアを（ツァイスから）使用してください。このソフトウェアの中で、&quot;アウトライン&quot;ツールを選択するオプションがあります。このツールを使用すると、それぞれの神経突起の長さを追跡するために、コンピュータのマウスを使用することができます。それはあなたの神経突起の正確な測定を得るために使用されていることを客観的に定義することが重要です。これらの分析を行うために、我々は通常、20倍対物レンズを使用してください。 </li></ol> 4。代表的な結果我々は、Sprague Dawley系産仔数は6と14の胚の間の範囲することを見出した。我々は通常、胚のすべてをエレクトロ。それぞれの胚は、DNAの異なる組み合わせでエレクトロことができます。しかし、我々は通常、これらの脳解離し、メッキの前に同じ条件とプールに少なくとも4つの頭脳をエレクトロ。 我々は、このテクニックでエレクトロポレーションの脳の約75％がそれは背内側や腹外側野（図1）であるかどうか、皮質の所望の領域をターゲットとしていることを発見した。さらに、我々はそのようなTbr1正の層のVIニューロン、後にエレクトロポレーションのターゲット間CTIP2正、TBR1負の層のV細胞、および、まだ後にエレクトロポレーションのターゲットBrn2正の層II / III細胞としてE13 - 14ターゲット深い層ニューロンで早期にエレクトロポレーションを発見した。別のマーカーとの皮質の神経細胞サブタイプの仕様の説明の優れた説明がMoleneauxら7による記事を見つけた。図2は15.5、17.5日胚のどちらかでエレクトロと生後5日目で収穫された脳の冠状断面を示しています。赤で示されてはOct6ために免疫染色される。あなたが標的としたものを細胞層の個体数を確認するために文化のマーカーを免疫染色することができます。我々はあなたが同じごみ（言い換えれば、ターゲットは他の技術的なバリエーションではなく、その後の胚タイムポイントに依存する）のすべての胚の細胞の同じ細胞層の人口をターゲットに期待できることを見出した。 文化では、GFP陽性の細胞のパーセントは、GFP陽性の領域（図3）を解剖しているときにどのように保守的に応じて多種多様であることができる。しかし、我々は非常に保守的であり、細胞の唯一のGFP陽性パッチを解剖する場合でも、我々が観察するという割合が最も高い5〜10％です - あなたは、エレクトロポレーションされた皮質の領域を解剖しているが、細胞だけつの層になります対象となる。この低いトランスフェクションeffciencyはプロセスが分析することelectoporatedセルに属しているかを特定するのに役立ちます。この高い密度でプレーティング細胞がheathier文化を持っていることに寄与する、しかし、GFP陰性細胞（図3）内のどの細胞体に属するプロセスがわかりにくいことです。 あなたがトラブルエレクトロポレーションした細胞の微細なプロセスのすべてが表示されない場合は、次のいずれかをあなたがGFPの発現を増加させるelectroporatingされているGFP DNAの濃度を増加させることができるか、Invitrogen社から抗GFP抗体を（使用して解離細胞を免疫染色することができます）Cy2と二次抗体と一緒に。 <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。E15.5のSprague - Dawleyラットを、プラスミドGFPでエレクトロと三日後に回収した。電極の配置に基づいて、皮質の異なる領域がターゲットされます。全体脳内AFショーGFP蛍光。 <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。E15.5（）またはE17.5（B）Sprague - Dawleyラットは、生後5日目にGFPプラスミドと収穫でエレクトロポレーションした。脳はcoronallyビブラトームを（100ミクロンの切片）を使用して、切片を固定し、Oct6（赤）のために免疫染色を行った。 AとBは、免疫染色切片の共焦点画像を示す。 <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。E15.5のSprague - Dawleyラットを、プラスミドGFPでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後24時間は、脳を採取し、GFP陽性、エレクトロポレーション領域は、ビデオで説明するように、解剖し、解離された。 in vitroでの3日後、細胞を固定し、免疫染色BIII -チューブリン（赤）およびDAPI（青）（A、C）で核を染色した。最も長い神経突起の長さはAxioVisionのソフトウェアを用いて測定した（B、D）。

<ol>
	<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain.">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference.">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1.">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

プライマリーニューロン培養の in vitro研究では神経突起伸長の定量分析を可能にする。神経突起伸長、shRNAまたはmisexpression構造にどのように影響する遺伝的変化を研究するために化学物質のトランスフェクションまたはウイルスの伝達を介して一次ニューロンに導入することができる。しかし、一次皮質細胞と、細胞の種類（別の層からグルタミン酸作動性ニューロン、抑制性?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cortical Neuron Preparation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14185-052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14065-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES pH 7.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630-080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dishes and Vials:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>
</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>351007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-547-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-554-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Tools:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>91402-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Forceps</td>
<td>
</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11273-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11255-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Miscellaneous:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reichert Bright-Line Hemacytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser Scientific</td>
<td>1490</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hand-Held Tally Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z169021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plating Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11960-051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F4135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Growth Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NEUROBASAL Medium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum-Free Supplement </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX -I Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin Reagent Solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immunostaining:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fixative, Washes, and Blocking Buffer:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>017-000-121 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibodies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>beta-III tubulin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>MAB1637</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAP2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB15452</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy3 anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>715-166-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy2 anti-chicken</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>703-226-155 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>D3571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide Preparation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC2 Coated Two-Chamber Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>154852</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KPL</td>
<td>71-00-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 x 60 mm Micro Cover Glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48393-106 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear nail polish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72180</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>995-2949</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>4015809TV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>buprenorphine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>1118217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BTX square wave electroporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BTXECM830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tweezertrodes, 7 mm, platinum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450488</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons

プライマリーニューロン培養の in vitro研究では神経突起伸長の定量分析が可能になります。神経突起の伸長にどのように影響する遺伝的変化を研究するために、shRNAまたはcDNA構築物は、化学物質のトランスフェクションまたはウイルスの伝達を介して一次ニューロンに導入することができる。しかし、一次皮質細胞と、細胞の種類（別の層からグルタミン酸作動性ニューロン、抑制性神経細胞、グリア細胞）の異種プールはこれらのメソッドを使用してトランスフェクトされる。胚性齧歯類の大脳皮質でのDNA構築物を導入するために子宮内エレクトロポレーションでの使用は、標的とする細胞の特定のサブセットを可能にする：初期胚大脳皮質のエレクトロポレーションは、大脳皮質の深い層をターゲットにしながら、後期胚の時点においてでエレクトロポレーションはより多くの表面的な層をターゲットにしています。さらに、皮質の背内側対腹側外側の領域のターゲット内の個々の胚の結果の頭部間の電極の差動配置。エレクトロポレーションに続いて、トランスフェクションされた細胞は、外解剖解離、および神経突起伸長の定量分析のためのin vitroでめっきすることができる。ここでは、定量的に皮質細胞のサブセットで、神経突起の伸長を測定するためのステップバイステップの方法を提供します。 子宮内エレクトロポレーションのための基本的なプロトコルはKriegsteinラボ1、2から二つのJoveの記事で詳細に説明されています。我々は、神経突起伸長における遺伝子機能の研究に子宮内エレクトロポレーションに適用される我々のプロトコルの説明に続いて最も重要な詳細、に焦点を当て、 子宮内エレクトロポレーションのために我々のプロトコルの概要について説明します。

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

子宮内エレクトロポレーションでは、生体内で神経前駆細胞をトランスフェクションするための貴重な方法です。電極の配置とエレクトロの発達タイムポイントに応じて、皮質細胞の特定のサブセットを対象とすることができます。標的細胞は、その後、in vivoまたは遺伝的改変の影響についてin vitroで分析することができます。

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

in-utero-electroporation-followed-primary-neuronal-culture-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

17.7K ビュー.  Brigham and Woman's Hospital and Harvard Medical School. 子宮内エレクトロポレーションでは、生体内で神経前駆細胞をトランスフェクションするための貴重な方法です。電極の配置とエレクトロの発達タイムポイントに応じて、皮質細胞の特定のサブセットを対象とすることができます。標的細胞は、その後、in vivoまたは遺伝的改変の影響についてin vitroで分析することができます?...

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

神経科学

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...