脂肪細胞の脆弱な性質のために、脂肪組織のサブタイプへの分解は困難であった。このプロトコルは、単一核の効果的な単一の単一の分離によってこれを克服するために開発されました。このワークフローは、核凝集体と細胞破片を最小限に抑えた高度に精製された単一核を提供します。
これは、数千の細胞の単一細胞転写プロファイリングに有利である。このシンプルで堅牢なプロトコルは、脂肪の居住細胞における脂肪細胞の組織レベルの組織を研究するために適用することができる。そして特に、フェノタイピングの開発に、ノックアウトおよびトランスジェニックマウスを脂肪分する。
このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、脂肪細胞の処理にあまり経験がない人が脂肪異質性を複製し、洞察できるように非常に重要です。マウスから脂肪組織を採取した後、ペーパータオルで乾かして、きれいな皿に入れます。消化バッファーに塩化カルシウムを加え、最終濃度の 10 mM にします。
次に、組織に少量を加え、十分にミンチします。調製した消化バッファーの約半分の量をひき肉に加えます。そして、血清ピペットを使用して、サンプルを50 mL遠心分離管に移します。
残りのバッファーで皿を洗い、50 mLチューブに加えます。サンプルを数回上下にピペットします。その後、200〜210rpmで振りながら摂氏37度で12〜15分間インキュベートします。
インキュベーション後、1~1体積比でサンプルに0.5%BSAを加え、ピペットでよく混ぜます。サンプルを室温で5分間5分間遠心分離し、上にアディポサイト画分を残してストロモ血管分率を回転させる。400 m のセル フィルターを使用して、上端分を 50 mL チューブにフィルターします。
次に、フィルターをチューブの上に逆さまにして、0.5%BSA を使用して新しいチューブにアディポサイトを移してフィルターを逆洗浄します。BSAの総容積を10〜15mLにし、血清ピペットでサンプルを上下にピペットします。その後、室温で5分間300 xgで再び遠心分離する。
遠心分離後、広いボアピペットチップを使用して、サンプルの最上層を氷上の新しい冷蔵チューブの上にある100mセルフィルターに慎重に移します。十分な量の核調製バッファーでフィルターをリンスし、それを廃棄します。このステップから、氷の上にサンプルを保管し、迅速に作業します。
サンプルを氷の上に2分間断続的に反転させ、チューブを混ぜます。その後、1000 xgで遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を取り除き、ペレットを1mLの核調製バッファーに再懸濁させる。
古いチューブの壁に触れないように、清潔なマイクロ遠心分離チューブにサンプルを移します。L RNase阻害剤あたり0.6単位を加え、混ぜます。次いで、サンプルをさらに10分間遠心分離する。
上清を取り除き、ペレットと1mLの核洗浄バッファーを再懸濁します。積み重ね可能な30 mフィルターを使用して、サンプルをクリーンチューブにダブルフィルターします。次いで、約300Lの核洗浄緩衝液でフィルターを洗浄する。
健康な核の正常な単離を確認するには、サンプルの小さなアリコートをトリパンで染色し、自動細胞カウンターを使用して平均死んだ大きさと死んだ細胞の割合を評価する。DAPIを用いた試料の小さなアリコートに染色し、20倍以上の目的で顕微鏡下で検査する。核は丸く、無傷の核膜を有するべきである。
白い矢印は、無傷の膜のない核を示す。FACSで核を片付けた後、摂氏4度で5分間500 xgの遠心分離機で濃縮してこのサンプルを濃縮します。次いで、それを適切な量の核洗浄緩衝液に再構成する。
L濃度当たり50~1500個の核を達成し、単細胞核RNAセクを進める。細胞の破片およびダブレットを除去するために、アディポサイト核は核凝集物および多重を除外するためにサイズおよび粒度のために分類される。最後に、DAPI ポジティブイベントのために。
このグレーディング戦略は、凝集および破片を最小限にする高度に精製された単核をもたらす。顕微鏡検査で検査する場合、ソートされた核は丸く、無傷の膜を持つべきである。核の精製に成功した場合、褐色のアディポサイトのマーカー遺伝子である新生Ucp1 mRNAのプライマーを用いたリアルタイムqRT-PCRでも行うことができます。
クロムプラットフォームは、マウス間肩蓋ブラウン脂肪組織から7500核のトランスクリプトームを決定した。t-SNE次元低減およびk-平均クラスタリングで7種類の細胞が明らかになった。すべてのクラスターは、Fabp4、パンアディポサイト遺伝子およびサブセットを発現し、高レベルのUcp1 mRNAを発現した。
核は単離され、その後確認されたが、このプロトコルは、10xゲノミクスからクロムを含む事実上任意の単細胞レベルの遺伝子発現プラットフォームに供することができる。
