このプロトコルは、キットタイプ、RNase R処理、入力量、およびcircRNA検出への影響など、circRNAライブラリ調製の主要な側面を評価した結果です。それは最適なサークRNAの検出を可能にし、ユーザーの必要性に応じて調節可能な変数のデータを提供する。異なるサンプルタイプのcircRNAを同定することは、その発現の分布をよりよく理解するのに役立ち、これらの分子の機能的役割を解明する段階を設定します。
この方法は、任意の合計RNAサンプルに適用することができる。プロトコルを開始する前に、RNAサンプルを氷の上に保管しておくことが重要です。準備前にアジレントバイオアナライザまたはテープステーションでRINとDV200の値を評価し、RNAを使用する場合は適切な手順に従ってください。
まず、合計RNAをRNaseフリーウォーターの39マイクロリットルで4マイクログラムに希釈し、上下にピペットして混合します。別のチューブでは、1x RNase Rバッファーを使用して、RNase Rをマイクロリットル当たり2単位の作業濃度に希釈します。ピペット39マイクロリットルの全RNAと5マイクロリットルの10倍RNase R反応バッファーを1.5マイクロリットル反応チューブに混合し、混合します。
希釈したRNase R.の6マイクロリットルを加え、ピペットを完全な反応量に調整し、上下にピペットを10回混ぜます。チューブを摂氏37度の水浴に10分間入れ、完全な反応量が水浴に浸かっていることを確認します。次いで、チューブを氷の上に置き、すぐにRNAのクリーンアップと濃縮を進めます。
始める前に、濃縮物に100%エタノールの48ミリリットルを混合してRNAウォッシュバッファーを調製し、精製カラムを回収管に入れます。準備ができたら、RNase R処理サンプルに2つの量のRNA結合バッファーを加え、よく混ぜます。100%エタノールの150マイクロリットルを混合物に加え、合計300マイクロリットル、全容をカラムに移し、遠心分離機を30秒間加えます。
流れを取り除き、400マイクロリットルのRNA準備バッファーをカラムに直接加えます。遠心分離機を30秒間、流れを捨てます。その後、カラムに700マイクロリットルのRNAウォッシュバッファーを加え、遠心分離機を30秒間加え、流れを通して廃棄します。
さらに400マイクロリットルのウォッシュバッファー、遠心分離機を2分間加え、カラムを新鮮なRNaseフリーの1.5ミリリットルチューブに移します。柱フィルターの真上にピペットチップを持って、RNaseフリー水11マイクロリットルを柱に直接慎重に加えます。サンプルを室温で1分間座らせてから、1分間遠心分離します。
1.5ミリリットルのチューブに流れが通っていることを確認し、カラムを捨てます。精製されたRNAサンプルは、マイナス80°Cで保存することも、ライブラリの調製にすぐに使用することもできます。精製した全RNAの10マイクロリットルを96ウェルPCRプレート内のクリーンウェルに移します。
rRNA結合バッファーの5マイクロリットルを追加し、rRNA除去ミックスの5マイクロリットルを追加し、試薬を混合するために上下にピペットを穏やかにピペット。プレートを密封し、事前にプログラムされ、予熱されたサーモサイクラーブロックで摂氏68度で5分間インキュベートします。インキュベーションの後、プレートを室温で1分間座らせます。
プレートからシールを取り出し、35マイクロリットルの渦中室温rRNA除去ビーズをサンプルに加えます。ピペットを45マイクロリットルに調整し、ピペットを10~20回上下に調整して完全に混合します。プレートを室温で1分間座らせます。
プレートを磁気スタンドに移し、1分間、または溶液がクリアされるまでインキュベートします。上清をプレート上の新しい井戸に移します。次に、磁気スタンドからプレートスタンドにプレートを移します。
ボルテックスRNAクリーンアップビーズは、それらが十分に分散されるまで、サンプルにビーズの99マイクロリットルを追加します。ピペットを上下に混ぜ合わせ、室温で10分間インキュベートします。プレートを磁気スタンドに移し、5分間放置するか、溶液がクリアするまで放置し、井戸からすべての上澄み物を取り出して捨てます。
磁気スタンドにプレートを残したまま、ビーズを破壊することなく、準備したての80%エタノールを200マイクロリットルのウェルに加えます。エタノールを井戸に30秒間放置し、取り除いて捨てます。ウェルに溶出バッファーの 11 マイクロリットルを追加し、ピペットを上下に混合します。
プレートを室温で2分間インキュベートし、磁気スタンドに戻し、溶液がクリアされるまでそこに保管します。8.5マイクロリットルの上清を同じプレート上の新しいウェルに移し、サンプルを含む各ウェルに8.5マイクロリットルのエルテ、プライマー、フラグメントハイミックスを加えます。ピペットを10回上下して完全に混ぜ、プレートを密封し、摂氏94度に予熱したサーモサイクラーで8分間インキュベートします。
サンプルを摂氏4度に冷却し、サーモサイクラーからプレートを取り出し、遠心分離機を短くします。このプロトコルについて、TruSeqとKAPAの2つのライブラリ調製キットを評価しました。全体として、TruSeqキットを使用した場合、より多くの円形RNAおよび低い割合のリボソームRNAが検出されたので、TruSeqはさらなる実験のために選択された。
RNase R前処理の意義は、前処理されたライブラリと非処理されたライブラリから生成されたデータを比較することによって評価した。予想通り、未治療ライブラリと比較して、より多くの円形RNAが一貫して前処理されたライブラリで同定された。入力RNAの量は、より高い多様性の円形RNAを検出するために最適化されました。
ライブラリーは、1マイクログラム、2マイクログラム、4マイクログラムの入力RNAを用いて作成し、4マイクログラムの全RNAを使用した場合には、円形RNA種の最も高い多様性が観察された。最適化されたプロトコルは、4つの健康なドナーからの5つの脳領域および6人の健康なドナーからの他の組織タイプの円形RNAの豊富さを比較するために使用された。全体として、他の組織タイプと比較して、脳内で円形RNaseの存在量が高いことが観察された。
手袋を着用する、RNaseワイプまたはスプレーでベンチとピペットを徹底的に洗浄する、事前にRNAを氷の上に保つなど、RNAを扱う場合は、適切な手順に従うことを忘れないでください。この手順に従って、同定されたcircRNA接合部のサンガーシーケンシングなどの直交検証を行うことができる。新しいcircRNAの発見とその存在のさらなる証拠は、その生物学的機能を探求するための新しい研究分野を切り出す。
