私たちは、視葉に特に重点を置いて、幼虫と成虫のショウジョウバエの脳を解剖、免疫染色、マウントするためのプロトコルについて説明します。視ローブの複雑な3次元組織を考えると、ここで説明するプロトコルは、研究者が実装方向と視覚化された視ローブ構造との関係をより深く理解するのに役立つと期待されます。このプロトコルでは、幼虫と成虫の両方の視葉に対する3つの取り付け戦略について説明しており、それぞれがイメージング中に特定の視葉構造を視覚化するための最適な角度を提供します。
解剖を開始する前に、3ウェルプレートのすべてのウェルにウェルあたり400マイクロリットルのPBSを充填し、鉗子を使用して、ショウジョウバエのバイアルまたはボトルの内側を這う15匹のさまよう3番目の幼虫を穏やかに選択します。すべての幼虫を3つのウェルプレートの最初のウェルに入れ、1つの幼虫をプレートの中央のウェルに移します。利き手ではない手を使って、井戸の根元で幼虫の体を拘束し、利き手を使って幼虫の口のフックをそっとつかみます。
マウスフックを体から引き離して脳を取り出します。その後、想像椎間板を含むアクセサリー組織を取り出します。次に、脳をプレートの3番目のウェルに入れます。
すべての脳を解剖したら、P200ピペットを使用して3番目のウェルからPBSを慎重に取り出し、脳を水没させるのに十分な溶液を残します。調製したばかりの500マイクロリットルの冷温固定溶液をウェルに加えます。脳が皿の中で渦巻くように鉗子で溶液を静かに攪拌し、ガラス顕微鏡スライドでウェルを覆います。
次に、皿を氷の上に30分間置き、ティッシュを固定します。400マイクロリットルの新鮮なPBSとトリトンで脳を5回洗います。これで、脳は一次抗体のインキュベーションの準備が整いました。
成体の脳解剖では、10〜15匹の成虫のハエに麻酔をかけ、氷の上の実験室のワイプに置きます。鉗子を使用して、翼で1匹の成虫のハエを、400マイクロリットルのPBSを含む3ウェル解剖プレートの1ウェルに静かに移します。利き手ではない手で一対の鉗子を使用して、ハエの胸部を井戸の基部に押し付け、利き手で超微細な鉗子を使用して、体の残りの部分から頭をそっと引き抜きます。
非利き手で体を実験室の拭き取りに捨て、利き手を使用して頭をテングで井戸の底に押し付けます。両方の鉗子を使用して、脳が露出するまで目の間のキューティクルの各領域を剥がし、脳に付着したままのアクセサリー組織をすべて取り除きます。洗浄した脳を3番目のウェルに入れ、示されているように次の脳を解剖し、15個の脳が得られるまで、または最大解剖期間が30分経過するまで行います。
500マイクロリットルの固定液で室温で20分間脳を固定し、示されているようにPBSとトリトンで脳を5回洗浄します。成体脳は、一次抗体のインキュベーションの準備が整いました。最後の洗浄液を2滴の蛍光性安全封入剤に交換して脳を沈め、新しいガラス顕微鏡スライドの中央に1滴の封入剤を追加します。
鉗子を使用して、腹側神経索で各幼虫の脳をつかみ、スライドに移します。外側の増殖中心の中央領域、椎弓または小葉プラグから前駆細胞とニューロンを視覚化するには、腹側神経索が葉の上に突き出ていることを確認し、組織の前面を上にして幼虫の脳をスライドに置きます。外側または内側の増殖センターの先端に属する細胞を視覚化するには、腹側神経索が葉の下から突き出ていることを確認してください。
幼虫の脳を組織の後側を上にしてスライドに置きます。背側腹側軸と内側外側軸の両方の内側と外側の増殖中心からニューロンの三日月形を視覚化するには、一対の鋭い鉗子またはタングステン針を使用して、葉の間の切断点から始めて、腹側神経索を介して脳葉を分割します。側面を上にして各ローブの向きを変えます。
幼虫の脳が適切に向きを変えたら、脳の両側に封入剤を少し垂らします。各ドロップに1つのカバースリップを置き、最後のカバースリップを脳の上に置き、右端と左端が他の2つのカバースリップに載るようにして、カバースリップブリッジを形成します。次に、マニキュアを使用してカバースリップブリッジの端をシールし、取り付けられた脳を固定します。
最後の二次抗体洗浄後、400マイクロリットルのPBSで最終洗浄を行います。PBSを3滴の蛍光安全封入剤と交換して、脳を沈めます。顕微鏡ガラススライドの左右の3分の1に封入剤を一滴加えます。
各ドロップにカバースリップを置き、カバースリップブリッジを構築します。右側のカバースリップの外縁をマニキュアで密封し、カバースリップの間に封入剤を1滴加えます。鉗子を使用して、視葉の損傷を防ぐために細心の注意を払って脳をスライドにそっと移します。
椎弓板ニューロンと髄質ニューロンの細胞体を視覚化するには、タングステン針を使用して、アンテナローブが外側に突き出た状態で脳を前方の位置に向けます。小葉複合体のニューロンを視覚化するには、触角葉がスライド位置に対して下を向くように、脳を後方に向けます。すべての視葉神経胞を1つの平面に視覚化するには、脳を水平位置に向け、脳を前方マウントに並べてから、タングステン針を使用して各脳を90度上向きに回転させ、カバースリップの端に載せて腹側に座るようにします。
成体の脳が適切な向きになったら、右端と左端が他の2つのカバースリップと重なるように最終的なカバースリップを脳の上に置き、ブリッジを形成し、スライドをマニキュアで密封します。これは、前方の取り付け方向の幼虫の視葉の画像です。前方の取り付け方向では、中央のより大きな増殖中心の上皮、髄質神経芽細胞、および椎弓板ニューロンが脳を包み込む細胞の帯として表面に現れます。
脳の深部、Zスタックの中央には、主要な外側増殖中心上皮とそれに対応する神経芽細胞とニューロンが見えます。さらに、これらの中間スライスには、内部増殖中心の上皮と小葉プラグのニューロンが見えます。最も深いZスライスは、外側の増殖中心の後端が位置する脳の反対側を示しています。
内部増殖中枢の表面的な先端も存在します。これらは、視葉が後方に取り付けられた場合に最初に見える構造であることに注意してください。これは、側面に取り付けられた光学ローブからの画像です。
横マウントの表面には、薄層三日月が見え、小葉栓三日月はその腕の間にあります。髄質ニューロンの三日月は、わずかに深いZ位置に現れます。これは、前方に取り付けられた成虫の視葉の画像です。
髄質は前方マウントの表面に位置しているため、髄質はすぐに見えます。皮質の細胞体は、その分枝化をニューロピルに投影し、中間のZ位置で視覚化することができます。小葉もこのレベルで現れ、髄質に対して垂直に向けられています。
視神経葉の最終的な神経乳である最も深いZ位置では、小葉板が見えます。小葉板は、後部マウントで最初に見える構造であることに注意してください。これは、水平方向に取り付けられた成虫の視葉の画像です。
脳を横向きに90度反転させて水平にすると、視葉のすべての神経回路と皮質が1つの平面に見えます。このプロトコルを実行するとき、覚えておくべき最も重要なことは、プロトコル全体を通して脳組織を溶液に浸したままにしておくことです。脳が空気にさらされると、汚れの品質、したがって最終的な画像の品質が大幅に低下します。
ライブイメージングでは、取り付け方向が視ローブの視覚化にどのように影響するかを理解することが重要です。幼虫と成虫の脳は、細胞分裂や自身の形態の変化を追跡するために、数日間にわたって培養および画像化することができます。ここでは、in vivoで蛍光シグナルを最適に検出するためには、目的の細胞タイプがカバースリップの近くにいる必要があるため、取り付け方向が重要です。
