これらのプロトコルは、任意の研究者が彼らの研究アジェンダを駆動または補完するためにショウジョウバエ細胞株の使用を組み込むのに役立ちます.すべてのショウジョウバエ細胞培養が、これらのガイドラインに従って取り扱われると、ほとんどが蘇生し、増殖し、凍結保存が良好である。70%エタノールで層流フードの作業面を拭き取った後、適切な媒体の5ミリリットルを25センチメートル平方のTフラスコに分配する。
70%エタノールで冷凍セルラインの容器を拭き、蓋を慎重に緩めて開封します。パスツールピペットを使用して、フラスコからクリオバイアルに室温培地1ミリリットルを移し、凍結した細胞を解凍するために穏やかに混合します。細胞懸濁液があふれないように注意し、解凍した細胞懸濁液の全容をフラスコに移し、新しい培地でクライオバイアルをすすいする。
細胞を25°Cインキュベーターで少なくとも2時間フラスコの底に沈下させます。長期間または液体窒素にマイナス80度の冷凍庫に戻って旅行のためにパッケージ化された凍結細胞を返さないで下さい。代わりに、できるだけ早く細胞を解凍します。
軽顕微鏡で付着を確認した後、フラスコをインキュベーターに戻す前に、上清を5ミリリットルの新鮮な培地にそっと交換します。あるいは、解凍後、細胞懸濁液を遠心分離のために15ミリリットル円錐形チューブに移し、ちょうど実証したようにT-25フラスコに播種する前に新鮮な培地の5ミリリットルでペレットを再懸濁させる。細胞が通過する準備ができているかどうかを判断するには、顕微鏡下で培養の形態と合流を調べる。
細胞密度と倍時間を考慮すると、細胞を最後にサブ培養した時、および培養中の微生物汚染の兆候がある。培養が非常にコンフルエントに見える場合は、培養上清の10ミリリットルを使用して、培養プレート底部から細胞を穏やかに外し、得られた単一細胞懸濁液中の生存細胞数を数えることによって細胞密度を決定する。細胞密度が適切な培地中で1ミリリットル当たり10〜6番目の細胞の間であれば細胞をサブ培養する。
新しい培養プレートに1ミリリットル当たり6番目の細胞に少なくとも10倍10回加え、所望の播種細胞密度を達成する。次に、オペレータイニシャル、日付、分割比、播種細胞密度、細胞ライン識別子、媒体、通過数、および抗生物質などの媒体の添加物でプレートを覆い、ラベルを付け、25°Cインキュベーターで継続的なインキュベートのためにプレートをプラスチック容器に入れます。付着細胞を100ミリ培養皿底部から外すために、まず上清のすべてを滅菌フラスコに移し、0.05%トリプシンEDTAの1ミリリットルのゆっくりとした添加で細胞をすすい出す。
トリプシン溶液が溶液を廃棄する前に成長面全体を覆っていることを確認するために穏やかに旋回します。次に、新鮮な0.05%トリプシンEDTAを1~2ミリリットルのプレートにそっと加え、25°Cインキュベーターにプレートを3~10分間入れます。細胞層が成長面から剥離し、滑り落ちるのを観察できる場合は、保存した上澄み物の9ミリリットルを添加してトリプシン活性を停止し、細胞の塊を解離するために細胞懸濁液を十分に混合する。
すべての細胞が外れると、成長する表面は明らかになるでしょう。Neubauer細胞計数スライドを使用して細胞を手動でカウントするには、まずヘモサイトメータースライドの表面を拭き、スリップを70%アルコールでカバーします。混合後、ヘモサイトメーターの各溝付きエッジに15マイクロリットルの細胞を加えて、両方のチャンバーを充填します。
細胞懸濁液は毛細管作用によって計数室に引き込まれる。10x顕微鏡の目的を使用して、平行線で結ばされたグリッドの中央にある1ミリメートルの平方領域内の100〜200個の細胞を数えます。次に、2番目のチャンバーで列挙を繰り返し、2つのカウントの平均を使用して、式に従って細胞密度を決定します。
ショウジョウバエ細胞株凍結保存のために、細胞ペレットを凍結培地の体積で再中断し、1ミリリットル当たり少なくとも10〜7番目の細胞の最終細胞密度をもたらす。最終的なDMSO濃度が10%になるように、細胞懸濁液に適切な量の凍結保護剤、ジメチルスルホキシドまたはDMSOを加え、細胞懸濁液を穏やかに混合する。次に、細胞懸濁液の0.5ミリリットルのアリコートを事前ラベル付けされたクライオバイアルに慎重に加え、イソプロパノールで満たされた凍結容器にクライオバイアルを入れます。
その後、凍結容器を一晩でマイナス80度の冷凍庫に移し、クライオバイアルの温度が冷凍庫の温度までゆっくりと下がるようにします。次に、液体窒素キャニスターに挿入するために、すぐに凍結バイアルを缶に移す。あるいは、冷凍クライオバイアルを冷却済みの冷凍ボックスに移し、凍結したクライオバイアルを窒素冷凍庫の液相に保管します。
細胞株の合流は、光顕微鏡によって決定することができる。早期に合流に達する急速に成長する細胞株は、週に2回まで定期的に通過する必要があります。対照的に、成長の遅い細胞は、少なくとも2週間に1回以上通過することができるが、これらの細胞は毎週新鮮な培地を供給する必要がある。
様々な組織源から誘導される細胞株は、その形態、付着特性、メディア要件、および倍時間が異なります。定量実験では、細胞数計が不可欠です。細胞は、ヘモサイトメーターまたは自動粒子カウンターを使用してカウントすることができます。
細胞合流は、経験豊富なオペレータのためのサブ培養するタイミングのための視覚的なガイドです。しかし、細胞数は予測可能なサブカルリングスケジュールにつながり、成長異常の検出を容易にします。液体窒素を使用する場合は、注意して適切な保護具を使用してください。
