この研究は、Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Awardの支援を受けた。いくつかの3Dプリントされたコンポーネントは、もともとファビアン・ラビュソー(画像誘導療法、フランス)によって設計されました。著者は、原稿の準備に技術的な支援をしてくれたジョン・ヒース(カリフォルニア工科大学)とマーガレット・スウィフト(カリフォルニア工科大学)に感謝します。

利益相反はありません。

ATACでは、正確なMRIガイド下ターゲティング、FUS-BBBO、遺伝子発現の組織学的評価など、特定の神経回路の神経調節を成功させるためのいくつかの技術の実装を成功させる必要があります。3Dプリント可能なコンポーネントは、イメージング誘導FUS-BBBOで小さな脳構造のターゲティングを簡素化するために開発されました。
MRIガイド下集束超音波(MRIgFUS)投与は、多くの課題をもたらします。まず、一般的なMRIコイルは、超音波ハードウェアではなく標本のみを収容するように設計された限られたスペースを持っています。MRIのより大きなボアは、信号がコイル32のフィルファクタに関連するので、機器のコストを増加させ、画質を低下させる。その結果、MRIで動物の画像の上部に配置されたFUSハードウェアは、画像品質を低下させます。第二に、MRI対応デバイスの設計は困難で費用がかかります。MRI対応材料は、反磁性であり、高周波照射時に渦電流が発生する傾向が低く、高磁場での磁化率が低い必要があります。導電性材料では、渦電流の発生またはその磁化率も画像品質に悪影響を及ぼします。最後に、利用可能なMRI互換材料は、固定装置フレームなどの精密ターゲティングマシンの製造に通常使用される金属よりもヤング率と耐久性が低くなっています。位置調整に使用されるモーターは、MRIに対応し、そのサイズのためにMRIボアの外側に配置する必要があります。これらのモーターは、MRI互換材料を使用して、MRIボア内のトランスデューサーに距離を置いて接続する必要があります。塑性反りの問題、堅牢なサイズのコンポーネントを実装するためのボア内の十分なスペースの欠如、および脳全体のターゲティング位置を変更するための不十分な余地が、以前の研究のターゲティング精度に影響を与えました。
これらの問題を解決するために、MRIでのイメージングとスキャナー外でのFUS-BBBO投与を行うことを決定しました。MRIガイダンスを可能にするために、マウスは、MRIとステレオタックス座標空間の両方でマウスの脳構造を局在化するために使用できるMRI可視ターゲティングガイドを備えた3Dプリントされた拘束具内に配置されました。マウスの頭蓋骨とターゲティングガイドの両方がイヤーバーホルダーにしっかりと取り付けられているため(図1a、b)、ターゲティングガイドを使用してMRI画像内の空間座標を相関させ、定位固定装置をゼロにすることができます。拘束装置には可動部品がなく、トランスデューサも含まれていないため、MRI内に収まる堅牢性と小型化を実現し、トランスデューサの電子機器からの信号干渉を排除しました。一部の材料の3DプリントされたサポートがMRIに表示されるため、ターゲティングガイド内のスペースはくり抜かれています(図1c)。定位固定装置キャリブレーションを可能にするために、アセンブリに穴が導入されました(図3)。超音波トランスデューサをステレオタックスの電極ホルダーに取り付け、セクション4(図1d)で説明したようにターゲティングを実行しました。トランスデューサーは、レベルプレーンからの逸脱を防ぐために、イヤーバーのハウジングによってその長さに沿って支持されるべきです。背腹方向のターゲティングは、環状アレイの位相シフトを使用して達成できます。
実用的なターゲティング精度は、超音波フォーカシングと頭蓋骨の減衰によって決まります。FUS−BBBO手順は、ラット11について詳細に記載されており、他の多くのモデル生物23、33、34およびヒト16、17において実施されている。超音波の焦点サイズの関係は周波数に反比例し、周波数が高いほどより正確な送達が可能になります。ただし、頭蓋骨の減衰は周波数35で増加し、頭蓋骨の加熱と皮質領域の損傷につながる可能性があります。正確なターゲティング戦略は、脳の部位によって異なります。全幅半最大圧力が脳組織内に収まる部位は、線条体、中脳、海馬などの多くの脳構造において予測可能で安全なBBB開口部を可能にする。脳の基部近くの領域は、マウスに特定の課題をもたらします。マウスの脳は背腹方向に約8〜10mmの大きさで、これは多くの市販のトランスデューサーの全幅半値サイズに匹敵します。その結果、頭蓋骨の底部を標的にすることは、外耳道、口、または気管に存在する骨および空気からの超音波反射をもたらし、高圧および低圧の予測不可能なパターンをもたらし得る36。これらの圧力のいくつかは、出血および組織損傷を引き起こすことが示されている慣性キャビテーション閾値を超える可能性がある37。頭蓋骨の基部近くに位置する領域を標的とするために、交差遺伝学38が、FUSビームで標的とされる領域よりも小さい領域に遺伝子発現を制限するために使用される交差ATAC7を使用することが好ましい場合がある。交差ATACの公表された例では、ドーパミン作動性細胞において遺伝子編集酵素(Cre38)を発現するトランスジェニック動物が、ドーパミン作動性細胞を含む領域のサブセクションにおいて超音波で標的化されている。最後に、皮質領域をFUSで標的にすることができますが、超音波の回折と反射が発生し、不均一な圧力プロファイルにつながる可能性があります。このプロトコルは、使用される種に大きく依存するため、皮質領域の標的化をカバーしていません。しかしながら、海馬7の上の皮質のいくらかの標的化(例えば、図7)が観察されており、少なくともマウスにおいて、可能であることを示す。
化学遺伝学的活性化剤の選択および投与量は、特定の実験的ニーズに依存する。著者の研究7の1つを含む多くの研究は、有意な非特異的反応を示さなかったが39,40、高用量(例えば、10 mg / kg)は、少なくとも場合によっては副作用を引き起こす可能性があります41。しかしながら、全ての行動実験と同様に、CNOおよびその代謝産物42の潜在的なオフターゲット活性のために、適切な対照31が不可欠である。このような対照には、DREADDを発現する動物へのCNOおよび生理食塩水対照の投与、および野生型動物へのCNOの投与、または特定の場合には、それぞれ化学遺伝学的受容体を発現する脳の同側部位と対側部位の比較が含まれます。さらに、最近の研究では、特異性が向上した多くの新しいDREADDアゴニストが明らかになりました28,29,43。他の化学遺伝学的受容体5、25、44もATAC手順と併せて使用することができる。
遺伝子発現の組織学的評価は、すべての動物について死後必要です。ごく一部の動物は、FUS-BBBO7後に遺伝子発現不良を示します。また、ミスターゲティングが可能なため、遺伝子発現の空間的精度や特異性を示す必要があります。注目すべきことに、一部のAAVは逆行性または順行性のトレース能力を示す可能性があり45 、正確な超音波ターゲティングにもかかわらず、超音波の標的部位から遠く離れたトランスフェクションを引き起こす可能性があります。発現された化学遺伝学的受容体がフルオロフォアに融合または共発現する場合、組織切片におけるフルオロフォアのイメージングは、局在および発現強度を評価するのに十分であり得る。しかし、多くの蛍光タンパク質は組織固定プロセスによって損傷を受けており、DREADDで頻繁に使用されるmCherryタンパク質の免疫染色は、以前の研究でより良いシグナルをもたらしました7。最後に、脳の特定の部分(海馬の顆粒状細胞層など)のニューロンの密度により、融合とは対照的に、IRES下で発現された核局在蛍光団を使用して細胞カウントを行うことは、核を容易にセグメント化し、DAPIやTO-PRO-3などの核染色で対比染色できるため、有益である可能性があります。c-Fos染色による神経調節を評価するには、核対比染色を行い、蛍光シグナルではなくc-Fos陽性核をカウントすることが不可欠です。場合によっては、細胞の破片が蛍光を示し、陽性細胞の測定値を混乱させる可能性があります。
FUS-BBBOによる薬物および遺伝子送達の限界には、侵襲的頭蓋内注射による送達よりも分解能が低いこと、および大量の注射薬物またはウイルスベクターが必要であることが含まれる。さらに、脳への直接注射は注射部位への排他的送達をもたらすが、FUS-BBBOは静脈内経路を使用するため、末梢組織への送達が可能である。神経調節のために化学遺伝学を使用することの制限には、遅いタイムスケールが含まれ、これは神経調節の強度の急速な変化を必要とするいくつかの行動プロトコルには不十分である可能性がある。

光遺伝学1,2や化学遺伝学3,4,5などの回路特異的な神経調節技術の使用は、神経回路障害としての精神状態についての理解を深めました。神経回路は、通常、特定の細胞型、脳領域、分子シグナル伝達経路、および活性化のタイミングによって定義されるため、研究が難しく、脳障害の治療において制御がさらに困難です。理想的には、研究と臨床アプリケーションの両方にとって、そのような制御は非侵襲的に発揮されますが、正確で非侵襲的な神経調節の両方を達成することは困難です。例えば、神経活性薬は非侵襲的に脳に到達することができますが、脳全体に作用することによって空間特異性を欠いています。一方、脳深部電気刺激療法は、特定の脳領域を制御することはできますが、特定の細胞型を制御することが難しく、手術とデバイスの配置が必要です6。
音響標的化学遺伝学7(ATAC)は、空間的、細胞型的、および時間的特異性を備えた神経調節を提供します。これは、空間ターゲティングのための集束超音波誘発血液脳関門開口(FUS-BBBO)、細胞型特異的プロモーターの制御下で遺伝子を非侵襲的に送達するためのアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)の使用、および薬物投与を介してトランスフェクトされた神経回路を選択的に調節するための操作された化学遺伝学的受容体の3つの技術を組み合わせたものです。FUSはFDA承認の技術であり、人間の脳を含む組織の深部にミリメートルの空間精度で焦点を合わせる超音波の能力を利用しています。高出力では、FUSは本態性振戦8に対するFDA承認の治療を含む非侵襲的標的アブレーションに使用されます。FUS-BBBOは、低強度超音波と全身投与されたマイクロバブルを組み合わせて、超音波焦点で血管内で振動し、BBB9の局所的で一時的な(6-24時間)および可逆的な開口部をもたらします。この開口部は、げっ歯類10および非ヒト霊長類15において著しい組織損傷なしに、タンパク質9、10、小分子11、およびウイルスベクター7、12、13、14の脳への送達を可能にする。FUS-BBBO16,17の臨床試験が進行中であり、この技術の治療応用の可能性を示しています。
AAVを使用したウイルス遺伝子送達も、最近のFDAおよびEUの規制当局の承認が主要なマイルストーンとして、CNS疾患の臨床使用に急速に進んでいます。最後に、デザイナードラッグによって排他的に活性化されるデザイナー受容体(DREADD)などの化学遺伝学的受容体18は、トランスジェニックまたはトランスフェクトされた動物におけるニューロン興奮に対する薬理学的制御を提供するために神経科学者によって広く使用されています19,20。DREADDは、内因性リガンドではなく合成化学遺伝学的分子に応答するように遺伝子操作されたGタンパク質共役型受容体(GPCR)であり、これらのリガンドを全身投与すると、DREADD発現ニューロンの興奮性が増加または低下します。これら3つの技術をATACに組み合わせると、空間的、細胞型、時間的精度で選択された神経回路の非侵襲的変調に使用できます。
ここでは、単純な3Dプリントされたターゲティング装置を使用して、マウスのFUS-BBBOで脳領域を正確にターゲティングするための方法論を含めることにより、FUS-BBBO11 の以前に公開されたプロトコルを拡張および更新します。また、FUS-BBBOのATACへの応用についても紹介する。化学遺伝学的受容体を有するAAVの送達に必要なステップ、および組織学による遺伝子発現および神経調節の評価を示す。この技術は、遺伝子発現または神経調節のために大きなまたは複数の脳領域を標的とする場合に特に適用可能である。例えば、皮質の広い領域は、FUS-BBBOで容易に形質導入され、化学遺伝学を用いて調節され得る。しかしながら、代替技術である頭蓋内注射による遺伝子送達は、多数の侵襲的注射および開頭を必要とするであろう。FUS-BBBOとそのアプリケーションであるATACは、脳領域が大きく、侵襲的に標的とするのが難しいさまざまなサイズの動物にスケーリングできます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

音響標的化学遺伝学(ATAC)は、特定の神経回路の非侵襲的制御を可能にします。ATACは、集束超音波(FUS)誘導血液脳関門開口(FUS-BBBO)、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子送達、および操作された化学遺伝学的タンパク質受容体およびそれらの同族リガンドによる細胞シグナル伝達の活性化の組み合わせによって、このような制御を実現します。ATACでは、単一の非侵襲的超音波アプリケーションを使用して、大脳領域と小脳領域の両方をミリメートルの精度でトランスデューシングすることが可能です。この形質導入は、後に、薬物を用いて自由に動く動物において、長期の、非侵襲的な、装置なしの神経調節を可能にすることができる。FUS-BBBO、AAV、および化学遺伝学は複数の動物で使用されてきたため、ATACは他の動物種での使用にもスケーラブルである必要があります。この論文では、以前に公開されたプロトコルを拡張し、複雑なMRI互換のFUSデバイスを必要とせずに、MRIガイダンスを使用してFUS-BBBOを使用して小さな脳領域への遺伝子送達を最適化する方法を概説します。このプロトコルでは、任意のラボで3Dプリントでき、さまざまな種やカスタム機器に合わせて簡単に変更できるマウスターゲティングおよび拘束コンポーネントの設計についても説明しています。再現性を高めるために、プロトコルでは、マイクロバブル、AAV、および静脈穿刺がATAC開発でどのように使用されたかを詳細に説明しています。最後に、ATACを利用した研究の予備調査を導くために、データの例が示されています。

ATACプロトコルを実行する最初のステップは、FUS-BBBOを所望の脳領域にターゲティングすることである。例えば、記載されたプロトコルに従って、海馬をFUS-BBBOで標的とし、造影剤およびAAV9を担持したDREADDをマウスに注射し、続いてマウスの脳の画像を取得するFLASH 3D MRIシーケンスを投与した。T1シグナルの増強は、海馬領域(図6)および脳の他の部分(図7)で達成されました。数週間後、DREADDは標的脳領域内で発現しました。多くのDREADDは蛍光レポーター(mCherryなど)に融合されていますが、ホルムアルデヒドによる灌流と固定のプロセスにより、これらのタンパク質の蛍光が大幅に減少することがわかりました。mCherryまたはDREADDに対する免疫染色は、以前の経験に基づいて、発現のより信頼性の高い検出につながりました(図8)。以前の実験では、マウスの~85%がFUS-BBBO7後に発現を示しました。DREADDの十分なレベルの発現の簡単なテストは、細胞レベルでそれらの機能をテストすることです。それは、例えば、CNO19、デスクロロクロザピン28、またはその他29などの化学発生的リガンドまたは生理食塩水コントロールを提供し、心臓灌流および固定の前に2時間待つことによって行うことができる。次に、脳切片を、ニューロンの活動が高まっていることを示すc-Fosタンパク質30とDREADDについて共免疫染色しました。DREADDを標的とした脳の部位が、生理食塩水7を投与された群と比較して、またはFUS-BBBOを受けなかった対側部位と比較して、化学遺伝学的リガンドを投与された群でc-Fos陽性のニューロン核の数が有意に多かった場合、実験は成功したと見なされました。注目すべきことに、これらのリガンドのいくつかは、DREADDの発現なしにニューロンを非特異的に活性化する可能性があります。例えば、CNOはマウスにおいて低レベルのクロザピンに代謝されることが示されており、これはBBBを通過し、高い効力でDREADDを活性化する27。しかし、非特異的な場所に結合することも示されました。すべての実験と同様に、化学遺伝学的研究にすべての適切なコントロールを含めることが重要です31。1つの可能な対照は、野生型マウスへの化学発生リガンドの投与であり、手順なしで、所望の行動学的または組織学的アッセイに対する薬物単独の効果を排除する。別の対照は、4つのグループを含めることができます:DREADD +リガンド、DREADD +ビヒクル、EGFP +リガンド、EGFP +ビヒクル、これはFUS-BBBOによる遺伝子送達と化学発生リガンドの両方の潜在的な影響を説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> 図1:ATACにおけるFUSのMRI誘導ターゲティングのプロセス。 (a)イヤーバー、ノーズコーン、MRIスキャナー内に収まるプラットフォームを備えたマウスの配置。(b)MRIで見える3Dプリントガイド(青)をイヤーバーフレームの端に取り付け、4本のスナップオンボルト(半透明の青)を含む表面MRIコイルのホルダーで所定の位置に固定しました。(c)矢状MRIでの3Dプリントされたガイドの外観(左パネル)、ガイドの下部と位置合わせされたトランスデューサーの仮想表現の下部(黄色の半円)。右パネルは、コロナビューからのMRI上の3Dプリントガイドの外観を示しています。明るい円は、MRIコントラストの強いポリジェットサポート材料でできていました。十字架はプラスチックで形成されました。黄色の円は、定位固定装置フレーム内のガイドと同心円状に位置合わせされたトランスデューサの位置を表します。(d)脳構造を標的とするために、仮想トランスデューサを、超音波コーン/ハウジングの厚さに一致するようにマウスの上のz方向に移動させた。この場合、ウォーターバスの厚さのため、正確なターゲティングのためにトランスデューサーをガイドから8.2 mm上に移動しました。MRI画像データを用いて脳の構造を選択し、そのMRI座標を書き留めて定位固定装置に入力しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> 図2:使用するソフトウェアのインターフェース。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> 図3:MRI座標空間を定位固定装置に一致させるプロセス。(a)探触子ホルダー内の3つの穴をMRIガイド内の3つの穴に位置合わせし、アセンブリ全体に屈曲を引き起こさずに3本の円錐形のターゲットボルトを挿入しました。(b)理想的には、3本のボルトすべてが穴の中心に配置されます。(c)位置合わせに不正確さがある場合、3本のボルトすべてが収まるわけではありません(たとえば、1°の小さな、おそらく知覚できないヨーの場合、反対側のボルトがMRIガイドに詰まっている間、1本のボルトだけが収まります。あるいは、ボルトが押し込まれたときにアセンブリ全体が目に見える屈曲がある可能性があります。(d)ボルト継手の拡大図。最高の精度を得るには、ボルトを同心円状に配置する必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> 図4:シリンジ内のマイクロバブルの迅速な再分布。 (a)シリンジは混合後5秒で撮影した。(b)1分後、1 mLツベルクリンシリンジの上部近くに気泡の濃縮物の一部を示すはっきりと見える層がありました。本実施例は、特に、マイクロバブルの溶液を用いた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> 図5:トランスデューサの中心をMRIガイドの中心に配置するプロセス。 (a)この論文に示すモデルでは、赤いキャリアは、 図3bに示す位置からここに示す位置に10.56mm前方に移動するように設計されています。(b)超音波処理の前に青色のMRIガイドを取り外し、超音波の通過を確実にするためにマウスとトランスデューサー(オレンジ色)の間に超音波ゲルを適用した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> 図6:BBB開口部のMRIによる可視化。(a)BBB開口部の軸方向図。矢印で示されたより明るい領域は、MRIT1 造影剤の血管外漏出を示す。(b)FUS-BBBO(矢じり)を標的とした背側海馬と海馬上の皮質の冠状図。(c)FUS-BBBOを標的とした中央海馬のコロナ状図(矢じり)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> 図7:本論文で説明した3ボルトターゲティングシステムを使用した4つの脳部位のターゲティングの例。矢じりのある領域は、MRI造影剤の拡散を伴うBBBの開口部を示した。4つのサイトは、下から上に、各BBB開口部の間に~150秒で連続してターゲットが付けられました。画像は、最後のBBBオープニングから2分以内に撮影されました。スケールバーは2mmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> 図8:DREADD発現の検出。 (a)DREADDに付着した蛍光色素の免疫染色(この場合はmCherry)は、いくつかの研究で信頼できる検出方法でした。(b)(a)と同じ条件で海馬を標的としたDREADDの別の代表的なセクションでは、mCherryの蛍光自体が強いバックグラウンドと比較的弱いシグナルを生成しました。(c)陰性対照として、AAVの全身注射を受けたが、FUS-BBBOを受けなかったマウスを使用した。mCherry免疫染色では有意な発現は見られません。スケールバーは500mmです(a、cのデータは7 から許可を得て、Copyright 2020 Nature-Springer)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

このプロトコルは、集束超音波血液脳関門(BBB)の開口部、結果として生じる遺伝子発現の評価、および組織学的検査による化学遺伝学的受容体の神経調節活性の測定による遺伝子送達に必要なステップを描写します。

脳構造を標的とし、化学遺伝学的神経調節を評価するための集束超音波誘発血液脳関門開口部

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.4K ビュー.  Rice University. このプロトコルは、集束超音波血液脳関門(BBB)の開口部、結果として生じる遺伝子発現の評価、および組織学的検査による化学遺伝学的受容体の神経調節活性の測定による遺伝子送達に必要なステップを描写します。

ビデオ: Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

神経科学

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

ラットモデルにおける集中超音波を用いた位置特異的血液脳関門開口へのベンチトップアプローチ

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase uptake of antibodies and engagement through transient opening of the blood-brain barrier (BBB). In our laboratory, we are developing therapeutic approaches for neurodegenerative diseases in which an antibody in various formats is delivered across the BBB using microbubbles, concomitant with focused ultrasound application through the skull targeting multiple spots, an approach we refer to as scanning ultrasound (SUS). The mechanical effects of microbubbles and ultrasound on blood vessels increases paracellular transport across the BBB by transiently separating tight junctions and enhances vesicle- mediated transcytosis, allowing antibodies and therapeutic agents to effectively cross. Moreover, ultrasound also facilitates the uptake of antibodies from the interstitial brain into brain cells such as neurons where the antibody distributes throughout the cell body and even into neuritic processes. In our studies, fluorescently labeled antibodies are prepared, mixed with in-house prepared lipid-based microbubbles and injected into mice immediately before SUS is applied to the brain. The increased antibody concentration in the brain is then quantified. To account for alterations in normal brain homeostasis, microglial phagocytosis can be used as a cellular marker. The generated data suggest that ultrasound delivery of antibodies is an attractive approach to treat neurodegenerative diseases.

Presented here is a protocol to transiently open the blood-brain barrier (BBB) either focally or throughout a mouse brain to deliver fluorescently-labeled antibodies and activate microglia. Also presented is a method to detect the delivery of antibodies and microglia activation by histology.

集束走査超音波を用いた脳への抗体の送達

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

ヒト多能性幹細胞由来の3次元血液脳関門モデル

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

著者スポットライト:In vitro血液脳関門モデルを使用したアルツハイマー病の調査に向けた個別化アプローチ 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

神経疾患のモデル化と治療標的化のための血液脳関門の in vitro 再構築

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

The neuromodulatory effects of focused ultrasound (FUS) have been demonstrated in animal models, and FUS has been used successfully to treat movement and psychiatric disorders in humans. However, despite the success of FUS, the mechanism underlying its effects&#160;on neurons remains poorly understood, making treatment optimization by tuning FUS parameters difficult. To address this gap in knowledge, we studied human neurons in vitro using neurons cultured from human-induced pluripotent stem cells (HiPSCs). Using HiPSCs allows for the study of human-specific neuronal behaviors in both physiologic and pathologic states. This report presents a protocol for using a high-throughput system that enables the monitoring and quantification of the neuromodulatory effects of FUS on HiPSC neurons. By varying the FUS parameters and manipulating the HiPSC neurons through pharmaceutical and genetic modifications, researchers can evaluate the neural responses and elucidate the neuro-modulatory effects of FUS on HiPSC neurons. This research could have significant implications for the development of safe and effective FUS-based therapies for a range of neurological and psychiatric disorders.

Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

Here, we present a protocol for using a high-throughput system that enables the monitoring and quantification of the neuromodulatory effects of focused ultrasound on human-induced pluripotent stem cell (HiPSC) neurons.

マルチウェル微小電極アレイにおけるヒト in vitro 神経培養の集束超音波ニューロモジュレーション

The neuromodulatory effects of focused ultrasound (FUS) have been demonstrated in animal models, and FUS has been used successfully to treat movement and ...

高精度TUS:音響シミュレーションと熱シミュレーションによる計画と実行

Pipeline for Planning and Execution of Transcranial Ultrasound Neuromodulation Experiments in Humans

Transcranial ultrasound stimulation (TUS) is an emerging non-invasive neuromodulation technique capable of manipulating both cortical and subcortical structures with high precision. Conducting experiments involving humans necessitates careful planning of acoustic and thermal simulations. This planning is essential to adjust for bone interference with the ultrasound beam's shape and trajectory and to ensure TUS parameters meet safety requirements. T1- and T2-weighted, along with zero-time echo (ZTE) magnetic resonance imaging (MRI) scans with 1 mm isotropic resolution, are acquired (alternatively computed tomography x-ray (CT) scans) for skull reconstruction and simulations. Target and trajectory mapping are performed using a neuronavigational platform. SimNIBS is used for the initial segmentation of the skull, skin, and brain tissues. Simulation of TUS is carried over with the BabelBrain tool, which uses the ZTE scan to produce synthetic CT images of the skull to be converted into acoustic properties. We use a phased array ultrasound transducer with electrical steering capabilities. Z-steering is adjusted to ensure that the target depth is reached. Other transducer configurations are also supported in the planning tool. Thermal simulations are run to ensure temperature and mechanical index requirements are within the acoustic guidelines for TUS in human subjects as recommended by the FDA. During TUS delivery sessions, a mechanical arm assists in the movement of the transducer to the required location using a frameless stereotactic localization system.

著者スポットライト:Advancing Human Brain Modulation - Optimized Protocols for Transcranial Ultrasound Stimulation Experiments

Transcranial ultrasound stimulation (TUS) is an emerging non-invasive neuromodulation technique that requires careful planning of acoustic and thermal simulations. The methodology describes an image processing and ultrasound simulation pipeline for efficient, user-friendly, streamlined planning for human TUS experimentation.

経頭蓋超音波ニューロモデュレーション実験のヒトにおける計画と実行のためのパイプライン

Transcranial ultrasound stimulation (TUS) is an emerging non-invasive neuromodulation technique capable of manipulating both cortical and subcortical ...