Questa ricerca è stata supportata dalla Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Diversi componenti stampati in 3D sono stati originariamente progettati da Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Francia). L'autore ringrazia John Heath (Caltech) e Margaret Swift (Caltech) per l'assistenza tecnica nella preparazione del manoscritto.

Nessun conflitto di interessi.

L'ATAC richiede l'implementazione di successo di diverse tecniche per la neuromodulazione di circuiti neurali specifici, tra cui un targeting accurato guidato dalla risonanza magnetica, FUS-BBBO e la valutazione istologica dell'espressione genica. I componenti stampabili in 3D sono stati sviluppati per semplificare il targeting di piccole strutture cerebrali con FUS-BBBO guidato dall'imaging.
La somministrazione di ultrasuoni focalizzati guidati dalla risonanza magnetica (MRIgFUS) pone una serie di sfide. Innanzitutto, la tipica bobina per risonanza magnetica ha uno spazio limitato, progettato per ospitare solo un campione e non l'hardware a ultrasuoni. I fori più grandi delle risonanze magnetiche aumentano il costo delle apparecchiature e diminuiscono la qualità dell'immagine, poiché il segnale è correlato al fattore di riempimento di una bobina32. Di conseguenza, qualsiasi hardware FUS posizionato sulla parte superiore di un'immagine animale nella risonanza magnetica comprometterà la qualità dell'imaging. In secondo luogo, la progettazione di dispositivi compatibili con la risonanza magnetica è difficile e costosa. I materiali compatibili con la risonanza magnetica devono essere diamagnetici, avere una bassa propensione a creare correnti parassite durante l'irradiazione a radiofrequenza e avere una bassa suscettibilità magnetica in campi magnetici elevati. In qualsiasi materiale conduttivo, anche la creazione di correnti parassite o la sua suscettibilità magnetica influirà negativamente sulla qualità dell'immagine. Infine, i materiali compatibili con la risonanza magnetica disponibili hanno moduli di Young e durata inferiori rispetto ai metalli tipicamente utilizzati nella produzione di macchine di puntamento precise, ad esempio telai stereotassici. I motori utilizzati per le regolazioni di posizione devono essere compatibili con la risonanza magnetica e posizionati al di fuori del foro della risonanza magnetica a causa delle loro dimensioni. Questi motori devono essere collegati a distanza al trasduttore all'interno di un foro per risonanza magnetica utilizzando materiali compatibili con la risonanza magnetica. I problemi di deformazione della plastica, la mancanza di spazio sufficiente all'interno del foro per implementare componenti di dimensioni robuste e lo spazio insufficiente per cambiare le posizioni di puntamento in tutto il cervello hanno influenzato la precisione del puntamento nei lavori precedenti.
Per risolvere questi problemi, è stata presa la decisione di eseguire l'imaging nella risonanza magnetica e la somministrazione di FUS-BBBO al di fuori dello scanner. Per consentire la guida alla risonanza magnetica, i topi sono stati inseriti all'interno di un sistema di ritenuta stampato in 3D che aveva una guida di puntamento visibile alla risonanza magnetica che poteva essere utilizzata per localizzare le strutture cerebrali del topo sia nella risonanza magnetica che nello spazio delle coordinate stereofiscali. Poiché sia il cranio del topo che la guida di puntamento sono saldamente fissati ai supporti della barra auricolare (Figura 1a,b), è possibile utilizzare una guida di puntamento per correlare le coordinate spaziali all'interno dell'immagine RM e azzerare gli strumenti stereotassici. Il sistema di ritenuta non ha parti mobili e non contiene un trasduttore, il che ci ha permesso di renderlo robusto e sufficientemente piccolo da poter essere inserito all'interno di una risonanza magnetica e di rimuovere l'interferenza del segnale dall'elettronica del trasduttore. Lo spazio all'interno della guida di puntamento è stato svuotato poiché il supporto stampato in 3D per alcuni materiali è visibile nella risonanza magnetica (Figura 1c). Sono stati introdotti dei fori nell'assieme per consentire la calibrazione della stereotax (Figura 3). Il trasduttore a ultrasuoni è stato collegato a un portaelettrodo di una stereotassi e il targeting è stato eseguito come descritto nella sezione 4 (Figura 1d). Il trasduttore deve essere supportato per tutta la sua lunghezza dall'alloggiamento di barre auricolari, evitando qualsiasi deviazione dal piano di livello. Il puntamento in direzione dorso-ventrale può essere ottenuto utilizzando sfasamenti in un array anulare.
La precisione pratica del puntamento è determinata dalla messa a fuoco degli ultrasuoni e dall'attenuazione del cranio. La procedura FUS-BBBO è stata descritta in dettaglio per i ratti 11 ed è stata implementata in un certo numero di altri organismi modello23,33,34 e nell'uomo 16,17. La relazione tra la dimensione della messa a fuoco degli ultrasuoni è inversamente proporzionale alla frequenza, dove frequenze più elevate possono portare a un'erogazione più precisa. Tuttavia, l'attenuazione del cranio aumenta con frequenze35 che possono portare al riscaldamento del cranio e al danneggiamento delle aree corticali. L'esatta strategia di targeting dipenderà dal sito del cervello. I siti in cui una pressione massima a tutta larghezza si adatta all'interno del tessuto cerebrale consentono un'apertura prevedibile e sicura della BBB in molte strutture cerebrali come lo striato, il mesencefalo e l'ippocampo. Le regioni vicine alla base del cervello rappresentano una sfida specifica nei topi. Il cervello del topo misura circa 8-10 mm in direzione dorso-ventrale, che è paragonabile alla metà della larghezza massima di molti trasduttori disponibili in commercio. Di conseguenza, il targeting nella parte inferiore del cranio può portare alla riflessione degli ultrasuoni dalle ossa e dall'aria presenti nei condotti uditivi, nella bocca o nella trachea, che possono portare a modelli imprevedibili di alte e basse pressioni36. Alcune di queste pressioni possono superare una soglia di cavitazione inerziale che ha dimostrato di causare sanguinamento e danni ai tessuti37. Per colpire le regioni che si trovano vicino alla base del cranio, può essere preferibile utilizzare ATAC7 intersezionale, dove la genetica intersezionale38 viene utilizzata per limitare l'espressione genica a un'area più piccola di quella mirata con il fascio FUS. Nell'esempio pubblicato di ATAC intersezionale, un animale transgenico che esprime un enzima di editing genetico (Cre38) nelle cellule dopaminergiche è stato preso di mira con gli ultrasuoni nella sottosezione della regione contenente le cellule dopaminergiche. Infine, le regioni corticali possono essere prese di mira con la FUS, ma la diffrazione e la riflessione degli ultrasuoni possono verificarsi portando a profili di pressione non uniformi. Questo protocollo non copre il targeting delle regioni corticali in quanto dipenderà fortemente dalle specie utilizzate; tuttavia, è stato osservato un certo targeting della corteccia sopra l'ippocampo 7 (ad esempio, la Figura 7) che indica che, almeno nei topi, è possibile.
La scelta di un attivatore chemiogenetico e il dosaggio dipenderanno dalle specifiche esigenze sperimentali. Un certo numero di studi, tra cui uno degli studi degli autori7, non ha mostrato alcuna risposta non specifica significativa39,40, mentre dosi più elevate (ad esempio, 10 mg/kg) possono produrre effetti collaterali, almeno in alcuni casi41. Tuttavia, come per tutti gli esperimenti comportamentali, controlli adeguati31 sono essenziali a causa della potenziale attività off-target del CNO e dei suoi metaboliti42. Tali controlli potrebbero includere la somministrazione di CNO e controlli salini ad animali che esprimono DREADDs e la somministrazione di CNO ad animali wild-type o, in alcuni casi specifici, un confronto tra siti ipsi- e controlaterali del cervello che esprimono rispettivamente recettori chemiogenetici e non esprimono. Inoltre, una recente ricerca ha rivelato un certo numero di nuovi agonisti DREADD con una migliore specificità28,29,43. Altri recettori chemiogenetici 5,25,44 possono anche essere utilizzati in combinazione con la procedura ATAC.
La valutazione istologica dell'espressione genica è necessaria post-mortem per ogni animale. Una piccola frazione di animali mostra una scarsa espressione genica dopo FUS-BBBO7. Inoltre, è necessario mostrare l'accuratezza spaziale e la specificità dell'espressione genica poiché è possibile un mis-targeting. Da notare che alcuni AAV possono mostrare capacità di tracciamento retrogrado o anterogrado45 e possono causare trasfezione lontano dal sito bersaglio con gli ultrasuoni, nonostante l'accurato targeting ecografico. Se il recettore chemiogenetico espresso è fuso o co-esprime un fluoroforo, l'imaging del fluoroforo in sezioni di tessuto può essere sufficiente per valutare la localizzazione e l'intensità dell'espressione. Tuttavia, molte proteine fluorescenti sono danneggiate dal processo di fissazione tissutale e l'immunocolorazione per la proteina mCherry, che viene spesso utilizzata con i DREADD, ha prodotto un segnale migliore negli studi precedenti7. Infine, a causa della densità dei neuroni in alcune parti del cervello (ad esempio, lo strato cellulare granulare nell'ippocampo), l'uso di fluorofori localizzati in modo nucleare espressi sotto IRES, al contrario delle fusioni, per eseguire conteggi cellulari può essere utile poiché i nuclei possono essere facilmente segmentati e controcolorati con coloranti nucleari, come DAPI o TO-PRO-3. Per valutare la neuromodulazione mediante colorazione c-Fos, è fondamentale eseguire la controcolorazione nucleare e contare i nuclei c-Fos positivi, piuttosto che qualsiasi segnale di fluorescenza. In alcuni casi, i detriti cellulari possono mostrare fluorescenza e confondere le misurazioni delle cellule positive.
I limiti del farmaco e della somministrazione genica con FUS-BBBO includono una risoluzione inferiore rispetto alla somministrazione con iniezioni intracraniche invasive e la necessità di maggiori quantità di farmaci iniettati o vettori virali. Inoltre, mentre un'iniezione diretta nel cervello si traduce in una consegna esclusiva in un sito iniettato, FUS-BBBO utilizza una via endovenosa con conseguente possibile consegna ai tessuti periferici. I limiti dell'uso della chemiogenetica per la neuromodulazione includono una scala temporale lenta, che può essere inadeguata ad alcuni protocolli comportamentali che richiedono rapidi cambiamenti nell'intensità della neuromodulazione.

L'uso di tecnologie di neuromodulazione circuito-specifiche, come l'optogenetica1,2 e la chemiogenetica 3,4,5, ha fatto progredire la nostra comprensione delle condizioni psichiatriche come disturbi del circuito neuronale. I circuiti neuronali sono difficili da studiare e ancora più difficili da controllare nel trattamento dei disturbi cerebrali perché sono tipicamente definiti da specifici tipi di cellule, regioni cerebrali, vie di segnalazione molecolare e tempi di attivazione. Idealmente, sia per la ricerca che per le applicazioni cliniche, tale controllo dovrebbe essere esercitato in modo non invasivo, ma è difficile ottenere una neuromodulazione precisa e non invasiva. Ad esempio, mentre i farmaci neuroattivi possono raggiungere il cervello in modo non invasivo, mancano di specificità spaziale agendo in tutto il cervello. D'altra parte, la stimolazione elettrica del cervello profondo può controllare specifiche regioni cerebrali, ma ha difficoltà a controllare specifici tipi di cellule e richiede un intervento chirurgico e il posizionamento di dispositivi6.
La chemiogenetica acusticamente mirata7 (ATAC) fornisce neuromodulazione con specificità spaziale, di tipo cellulare e temporale. Combina tre tecniche: l'apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati (FUS-BBBO) per il targeting spaziale, l'uso di vettori virali adeno-associati (AAV) per fornire in modo non invasivo geni sotto il controllo di promotori specifici del tipo di cellula e recettori chemiogenetici ingegnerizzati per modulare selettivamente i circuiti neurali trasfettati tramite la somministrazione di farmaci. FUS è una tecnologia approvata dalla FDA che sfrutta la capacità degli ultrasuoni di mettere a fuoco in profondità all'interno dei tessuti, compreso il cervello umano, con precisione spaziale millimetrica. Ad alta potenza, la FUS viene utilizzata per l'ablazione mirata non invasiva, incluso un trattamento approvato dalla FDA per il tremore essenziale8. FUS-BBBO combina gli ultrasuoni a bassa intensità con microbolle somministrate per via sistemica, che oscillano nei vasi sanguigni al fuoco dell'ultrasuono, provocando un'apertura localizzata, temporanea (6-24 h) e reversibile della BBB9. Questa apertura consente la consegna delle proteine9,10, delle piccole molecole 11 e dei vettori virali7,12,13,14 al cervello senza danni tissutali significativi nei roditori 10 e nei primati non umani 15. Sono in corso studi clinici per FUS-BBBO16,17, che indicano possibili applicazioni terapeutiche di questa tecnica.
Anche la somministrazione genica virale con AAV sta rapidamente avanzando nell'uso clinico per i disturbi del sistema nervoso centrale, con le recenti approvazioni normative della FDA e dell'UE come pietre miliari importanti. Infine, i recettori chemiogenetici18, come i Designer Receptors Activated Exclusively by Designer Drugs (DREADDs), sono ampiamente utilizzati dai neuroscienziati per fornire il controllo farmacologico sull'eccitazione neuronale in animali transgenici o trasfettati 19,20. I DREADD sono recettori accoppiati a proteine G (GPCR) che sono stati geneticamente modificati per rispondere a molecole chemiogenetiche sintetiche piuttosto che a ligandi endogeni, in modo tale che la somministrazione sistemica di questi ligandi aumenti o riduca l'eccitabilità dei neuroni che esprimono DREADD. Quando queste tre tecnologie vengono combinate in ATAC, possono essere utilizzate per la modulazione non invasiva di circuiti neurali selezionati con precisione spaziale, di tipo cellulare e temporale.
Qui, espandiamo e aggiorniamo un protocollo precedentemente pubblicato per FUS-BBBO11 includendo una metodologia per il targeting accurato delle regioni cerebrali con FUS-BBBO nei topi utilizzando semplici apparecchiature di targeting stampate in 3D. Mostriamo anche un'applicazione di FUS-BBBO ad ATAC. Mostriamo i passaggi necessari per la somministrazione di AAV che trasportano recettori chemiogenetici e la valutazione dell'espressione genica e della neuromodulazione mediante istologia. Questa tecnica è particolarmente applicabile per il targeting di regioni cerebrali grandi o multiple per l'espressione genica o la neuromodulazione. Ad esempio, un'ampia area di una corteccia può essere facilmente trasdotta con FUS-BBBO e modulata utilizzando la chemiogenetica. Tuttavia, la somministrazione genica con una tecnica alternativa, le iniezioni intracraniche, richiederebbe un gran numero di iniezioni invasive e craniotomie. FUS-BBBO e la sua applicazione, ATAC, possono essere adattati ad animali di diverse dimensioni, dove le regioni cerebrali sono più grandi e più difficili da colpire in modo invasivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

La chemiogenetica a bersaglio acustico (ATAC) consente il controllo non invasivo di specifici circuiti neurali. L'ATAC raggiunge tale controllo attraverso una combinazione di apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati (FUS-BBBO), somministrazione genica con vettori virali adeno-associati (AAV) e attivazione della segnalazione cellulare con recettori proteici ingegnerizzati, chemiogenetici e i loro ligandi affini. Con l'ATAC è possibile trasdurre regioni cerebrali grandi e piccole con precisione millimetrica utilizzando un'unica applicazione ecografica non invasiva. Questa trasduzione può successivamente consentire una neuromodulazione a lungo termine, non invasiva e priva di dispositivi in animali che si muovono liberamente utilizzando un farmaco. Poiché FUS-BBBO, AAV e chemiogenetica sono stati utilizzati in più animali, l'ATAC dovrebbe essere scalabile anche per l'uso in altre specie animali. Questo documento espande un protocollo precedentemente pubblicato e delinea come ottimizzare la consegna genica con FUS-BBBO a piccole regioni cerebrali con guida per la risonanza magnetica, ma senza la necessità di un complicato dispositivo FUS compatibile con la risonanza magnetica. Il protocollo, inoltre, descrive la progettazione di componenti di puntamento e contenimento del mouse che possono essere stampati in 3D da qualsiasi laboratorio e possono essere facilmente modificati per diverse specie o attrezzature personalizzate. Per favorire la riproducibilità, il protocollo descrive in dettaglio come le microbolle, gli AAV e la venipuntura sono stati utilizzati nello sviluppo dell'ATAC. Infine, vengono mostrati alcuni dati esemplificativi per guidare le indagini preliminari degli studi che utilizzano l'ATAC.

Il primo passo per eseguire il protocollo ATAC è il targeting del FUS-BBBO verso le regioni cerebrali desiderate. Ad esempio, seguendo il protocollo descritto, l'ippocampo è stato preso di mira con FUS-BBBO e l'agente di contrasto e i DREADD portatori di AAV9 sono stati iniettati nei topi, seguiti da una sequenza di risonanza magnetica FLASH 3D che acquisisce immagini del cervello del topo. Un miglioramento del segnale T1 è stato ottenuto nella regione dell'ippocampo (Figura 6) e in altre parti del cervello (Figura 7). Dopo diverse settimane, i DREADD sono stati espressi all'interno della regione cerebrale bersaglio. Mentre molti DREADD sono fusi con un reporter fluorescente (ad esempio mCherry), è stato scoperto che il processo di perfusione e fissazione con la formaldeide riduce drasticamente la fluorescenza di queste proteine. L'immunocolorazione contro mCherry o DREADD ha portato a un rilevamento più affidabile dell'espressione (Figura 8) sulla base dell'esperienza precedente. In esperimenti precedenti, ~85% dei topi ha mostrato espressione dopo FUS-BBBO7. Un semplice test per livelli sufficienti di espressione dei DREADD è testare la loro funzionalità a livello cellulare. Può essere fatto, ad esempio, fornendo un ligando chemiogenetico o un controllo salino, come CNO 19, descloroclozapina28 o altri29, e attendere 2 ore prima di una perfusione cardiaca e fissazione. Le sezioni cerebrali sono state poi co-immunocolorate per la proteina c-Fos30, che indica una maggiore attività dei neuroni, e per DREADD. L'esperimento è stato considerato un successo se il sito del cervello bersaglio con DREADD ha mostrato un numero significativamente più elevato di nuclei neuronali positivi a c-Fos nel gruppo che ha ricevuto un ligando chemiogenetico rispetto al gruppo che ha ricevuto soluzione fisiologica7 o rispetto a un sito controlaterale che non è stato sottoposto a FUS-BBBO. Da notare che c'è la possibilità per alcuni di questi ligandi di attivare i neuroni in modo non specifico senza l'espressione di DREADD. Ad esempio, è stato dimostrato che il CNO viene metabolizzato in bassi livelli di clozapina nei topi, che attraversa la BBB e attiva i DREADD ad alta potenza27. Tuttavia, è stato anche dimostrato che si lega a posizioni non specifiche. Come in ogni esperimento, è fondamentale includere tutti i controlli appropriati negli studi chemiogenetici31. Un possibile controllo è la somministrazione del ligando chemiogenetico a topi wild-type, senza procedure, per escludere gli effetti del farmaco da solo sul test comportamentale o istologico desiderato. Un altro controllo potrebbe essere l'inclusione di quattro gruppi: DREADD + ligando, DREADD + veicolo, EGFP + ligando, EGFP + veicolo, che terrà conto di eventuali effetti potenziali sia del rilascio genico con FUS-BBBO che del ligando chemiogenetico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Figura 1: Il processo di targeting guidato dalla risonanza magnetica di FUS in ATAC. (a) Posizionamento del mouse con barre auricolari, un cono nasale e una piattaforma che può essere inserita all'interno di uno scanner MRI. (b) Una guida stampata in 3D (blu) visibile nella risonanza magnetica è stata attaccata alle estremità del telaio della barra auricolare e quindi fissata in posizione con un supporto di una bobina per risonanza magnetica superficiale che contiene quattro bulloni a scatto (blu semitrasparente). (c) Aspetto della guida stampata in 3D nella risonanza magnetica sagittale (pannello di sinistra), con una parte inferiore della rappresentazione virtuale di un trasduttore allineata (semicerchio giallo) con la parte inferiore della guida. Il pannello di destra mostra l'aspetto della guida stampata in 3D sulla risonanza magnetica dalla vista coronale. Il cerchio luminoso è stato realizzato con un materiale di supporto polyjet che ha un forte contrasto MRI. La croce è stata formata con la plastica. Un cerchio giallo rappresenta la posizione del trasduttore che è stato allineato concentricamente con la guida all'interno di un telaio stereotassico. (d) Per colpire le strutture cerebrali, un trasduttore virtuale è stato spostato in direzione z sopra i topi per abbinare lo spessore di un cono / alloggiamento a ultrasuoni. In questo caso, a causa dello spessore del bagno d'acqua, il trasduttore è stato spostato di 8,2 mm sopra la guida per un puntamento accurato. Le strutture cerebrali sono state selezionate utilizzando i dati di imaging della risonanza magnetica e le loro coordinate della risonanza magnetica sono state quindi annotate e inserite nella macchina stereotassica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Figura 2: Interfaccia del software utilizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Figura 3: Processo di corrispondenza dello spazio delle coordinate della risonanza magnetica allo strumento stereotassico. (a) Tre fori all'interno di un supporto del trasduttore sono stati allineati con tre fori all'interno della guida MRI e tre bulloni di puntamento conici sono stati inseriti senza causare la flessione dell'intero gruppo. (b) Idealmente, tutti e tre i bulloni dovrebbero trovarsi al centro dei fori. (c) Se c'è qualche imprecisione nell'allineamento, non tutti e tre i bulloni si adatterebbero, ad esempio, in caso di piccola imbardata probabilmente impercettibile di 1°, solo un bullone si adatterebbe mentre i bulloni opposti sarebbero bloccati alla guida MRI. In alternativa, potrebbe esserci una flessione visibile dell'intero gruppo quando i bulloni sono stati forzati. (d) Vista ingrandita del bullone. I bulloni devono essere posizionati concentricamente per la massima precisione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Figura 4: Rapida ridistribuzione delle microbolle all'interno della siringa. (a) La siringa è stata fotografata 5 secondi dopo la miscelazione. (b) Un minuto dopo, c'era uno strato chiaramente visibile che mostrava alcune delle bolle concentrate vicino alla parte superiore della siringa di tubercolina da 1 ml. Questo esempio, in particolare, ha utilizzato una soluzione di microbolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Figura 5: Processo di posizionamento del centro di un trasduttore su un centro di una guida MRI. (a) Nei modelli illustrati in questo documento, il supporto rosso è stato progettato per spostarsi di 10,56 mm in avanti dalla posizione mostrata nella Figura 3b a quella mostrata qui. (b) La guida blu per la risonanza magnetica è stata rimossa prima della sonicazione ed è stato applicato un gel ad ultrasuoni tra il topo e il trasduttore (arancione) per garantire il passaggio degli ultrasuoni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Figura 6: Visualizzazione RM dell'apertura della BBB. (a) Vista assiale dell'apertura BBB. L'area più luminosa designata con una punta di freccia mostra lo stravaso di un mezzo di contrasto MRI T1 . (b) Vista coronale dell'ippocampo dorsale e della corteccia sopra l'ippocampo bersaglio con FUS-BBBO (punte di freccia). (c) Vista coronale dell'ippocampo centrale bersaglio con FUS-BBBO (punte di freccia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Figura 7: Esempio di targeting di 4 siti cerebrali utilizzando il sistema di targeting a tre bulloni descritto in questo articolo. Le aree con punte di freccia mostravano siti aperti di BBB con diffusione di un mezzo di contrasto per risonanza magnetica. I quattro siti sono stati presi di mira in successione, con ~150 s tra ogni apertura BBB, dal basso verso l'alto. L'immagine è stata scattata entro 2 minuti dall'ultima apertura BBB. La barra della scala è di 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Figura 8: Rilevamento dell'espressione DREADD.  (a) L'immunocolorazione per il fluoroforo attaccato ai DREADD, in questo caso mCherry è stato un metodo affidabile di rilevamento in alcuni studi. (b) In un'altra sezione rappresentativa con DREADDs mirati all'ippocampo utilizzando le stesse condizioni di (a), la fluorescenza di mCherry da sola ha prodotto un forte fondo e un segnale relativamente debole. (c) Come controllo negativo, è stato utilizzato un topo che ha ricevuto un'iniezione sistemica di AAV, ma non è stato sottoposto a FUS-BBBO. Nessuna espressione significativa può essere trovata dall'immunocolorazione mCherry. Le barre della scala sono di 500 mm. (Dati in a, c adattati da7 con autorizzazioni, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Questo protocollo delinea le fasi necessarie per la veicolazione genica attraverso l'apertura della barriera ematoencefalica (BBB) ad ultrasuoni focalizzati, la valutazione dell'espressione genica risultante e la misurazione dell'attività di neuromodulazione dei recettori chemiogenetici attraverso test istologici.

Apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati per il targeting delle strutture cerebrali e la valutazione della neuromodulazione chemiogenetica

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

focused-ultrasound-induced-blood-brain-barrier-opening-for-targeting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.4K Views.  Rice University. Questo protocollo delinea le fasi necessarie per la veicolazione genica attraverso l'apertura della barriera ematoencefalica (BBB) ad ultrasuoni focalizzati, la valutazione dell'espressione genica risultante e la misurazione dell'attività di neuromodulazione dei recettori chemiogenetici attraverso test istologici.

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ricerca

Neuroscienze

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Un approccio da banco all'apertura della barriera ematica specifica della posizione utilizzando ultrasuoni focalizzati in un modello di ratto

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Un neuronavigation stereotattico guidato da immagini ad alta produttività e un sistema ad ultrasuoni focalizzati per l'apertura della barriera ematico-encefalica nei roditori

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase uptake of antibodies and engagement through transient opening of the blood-brain barrier (BBB). In our laboratory, we are developing therapeutic approaches for neurodegenerative diseases in which an antibody in various formats is delivered across the BBB using microbubbles, concomitant with focused ultrasound application through the skull targeting multiple spots, an approach we refer to as scanning ultrasound (SUS). The mechanical effects of microbubbles and ultrasound on blood vessels increases paracellular transport across the BBB by transiently separating tight junctions and enhances vesicle- mediated transcytosis, allowing antibodies and therapeutic agents to effectively cross. Moreover, ultrasound also facilitates the uptake of antibodies from the interstitial brain into brain cells such as neurons where the antibody distributes throughout the cell body and even into neuritic processes. In our studies, fluorescently labeled antibodies are prepared, mixed with in-house prepared lipid-based microbubbles and injected into mice immediately before SUS is applied to the brain. The increased antibody concentration in the brain is then quantified. To account for alterations in normal brain homeostasis, microglial phagocytosis can be used as a cellular marker. The generated data suggest that ultrasound delivery of antibodies is an attractive approach to treat neurodegenerative diseases.

Presented here is a protocol to transiently open the blood-brain barrier (BBB) either focally or throughout a mouse brain to deliver fluorescently-labeled antibodies and activate microglia. Also presented is a method to detect the delivery of antibodies and microglia activation by histology.

Consegna di anticorpi nel cervello utilizzando ultrasuoni a scansione focalizzata

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Un modello 3D di barriera emato-encefalica derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Autore in primo piano: Un approccio personalizzato verso lo studio della malattia di Alzheimer utilizzando un modello di barriera emato-encefalica in vitro 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

The neuromodulatory effects of focused ultrasound (FUS) have been demonstrated in animal models, and FUS has been used successfully to treat movement and psychiatric disorders in humans. However, despite the success of FUS, the mechanism underlying its effects&#160;on neurons remains poorly understood, making treatment optimization by tuning FUS parameters difficult. To address this gap in knowledge, we studied human neurons in vitro using neurons cultured from human-induced pluripotent stem cells (HiPSCs). Using HiPSCs allows for the study of human-specific neuronal behaviors in both physiologic and pathologic states. This report presents a protocol for using a high-throughput system that enables the monitoring and quantification of the neuromodulatory effects of FUS on HiPSC neurons. By varying the FUS parameters and manipulating the HiPSC neurons through pharmaceutical and genetic modifications, researchers can evaluate the neural responses and elucidate the neuro-modulatory effects of FUS on HiPSC neurons. This research could have significant implications for the development of safe and effective FUS-based therapies for a range of neurological and psychiatric disorders.

Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

Here, we present a protocol for using a high-throughput system that enables the monitoring and quantification of the neuromodulatory effects of focused ultrasound on human-induced pluripotent stem cell (HiPSC) neurons.

Neuromodulazione ad ultrasuoni focalizzati di colture neurali umane in vitro in array di microelettrodi multi-pozzetto

The neuromodulatory effects of focused ultrasound (FUS) have been demonstrated in animal models, and FUS has been used successfully to treat movement and ...

TUS ad alta precisione: pianificazione ed esecuzione con simulazioni acustiche e termiche

Pipeline for Planning and Execution of Transcranial Ultrasound Neuromodulation Experiments in Humans

Transcranial ultrasound stimulation (TUS) is an emerging non-invasive neuromodulation technique capable of manipulating both cortical and subcortical structures with high precision. Conducting experiments involving humans necessitates careful planning of acoustic and thermal simulations. This planning is essential to adjust for bone interference with the ultrasound beam's shape and trajectory and to ensure TUS parameters meet safety requirements. T1- and T2-weighted, along with zero-time echo (ZTE) magnetic resonance imaging (MRI) scans with 1 mm isotropic resolution, are acquired (alternatively computed tomography x-ray (CT) scans) for skull reconstruction and simulations. Target and trajectory mapping are performed using a neuronavigational platform. SimNIBS is used for the initial segmentation of the skull, skin, and brain tissues. Simulation of TUS is carried over with the BabelBrain tool, which uses the ZTE scan to produce synthetic CT images of the skull to be converted into acoustic properties. We use a phased array ultrasound transducer with electrical steering capabilities. Z-steering is adjusted to ensure that the target depth is reached. Other transducer configurations are also supported in the planning tool. Thermal simulations are run to ensure temperature and mechanical index requirements are within the acoustic guidelines for TUS in human subjects as recommended by the FDA. During TUS delivery sessions, a mechanical arm assists in the movement of the transducer to the required location using a frameless stereotactic localization system.

Autore in primo piano: Avanzamento della modulazione del cervello umano - Protocolli ottimizzati per esperimenti di stimolazione ecografica transcranica

Transcranial ultrasound stimulation (TUS) is an emerging non-invasive neuromodulation technique that requires careful planning of acoustic and thermal simulations. The methodology describes an image processing and ultrasound simulation pipeline for efficient, user-friendly, streamlined planning for human TUS experimentation.

Pipeline per la pianificazione e l'esecuzione di esperimenti di neuromodulazione ecografica transcranica nell'uomo

Transcranial ultrasound stimulation (TUS) is an emerging non-invasive neuromodulation technique capable of manipulating both cortical and subcortical ...