血液と脊髄の関門はしっかりと結合しており、透過性は限られています。このプロトコルにより、研究者はマイクロバブルと集束超音波を使用して、安全かつ一過性に血液-脊髄関門を開くことができます。この技術により、血液-脊髄関門の開口部を標的とする脊髄セグメントに局在化させることができます。
さらに、破壊は目視観察または蛍光顕微鏡検査によって簡単に確認できます。このプロトコルは、腫瘍、萎縮、または傷害の治療のために脊髄への遺伝子治療または薬物の送達を改善する可能性を探ることができます。手順を実演するのは、Meghana Bhimreddyです。
私の研究室の優秀な医学博士課程の学生で、日常的に工学と医学のギャップを埋めています。まず、ラットの血液脊髄関門またはBSCB開口部を達成するのに十分な仕様の集束超音波トランスデューサーシステムを入手します。3Dプリントされたプローブホルダーとウォーターコーンをトランスデューサーに取り付けます。
コーンとトランスデューサーの間に防水シールがあることを確認してください。滅菌した厚さ50ミクロンの音響透過性ポリエステル膜を、輪ゴムを使用してウォーターコーンの底に固定します。入口と出口のチューブを使用して、脱気および脱イオン水でウォーターコーンを満たします。
コーン内の気泡は、探触子とターゲットの間の音響結合を乱す可能性があるため、避けてください。この段階で、マイラー膜をわずかに膨らませる必要があります。波動発生器と高周波駆動アンプを含む駆動機器をトランスデューサーに接続します。
定位アームを固定プレートに固定し、プローブホルダーをアームに取り付けます。麻酔をかけたSprague-Dawley雌ラットの体重を記録し、つま先と尾のつまみテストを行い、麻酔を確認します。加熱パッドと滅菌吸収パッドを固定プレートに置きます。
ラットを吸収パッドの上に置きます。眼軟膏を塗り、直腸体温計を置いて体温を監視します。第13胸椎の脊椎に付着しているラットの最後の肋骨を触診します。
電気カミソリを使用して、最後の肋骨と首の間の背側表面の毛皮を剃ります。露出した皮膚を10%ヨードポビドンに浸したガーゼで拭きます。虹彩はさみを使用して正中線切開を作成し、棘突起と椎弓が露出するまで筋膜を解剖します。
脊髄が露出するまで、オフセットボーンニッパーと角度付きブレードアイリスハサミで骨を取り除きます。椎弓切除術に隣接する有棘突起をクランプすることにより、ラットを固定プレートに固定します。次に、クランプを少し引っ張って背骨をぴんと張らせます。
椎弓切除術の真上に位置するまで、定位アームでトランスデューサーの位置を調整します。ウォーターコーンの底にレーザー装置を取り付け、レーザーポイントが見えるまで下げます。次に、レーザーポイントがBSCB破壊のターゲット位置より上になるまで、トランスデューサの横方向の位置を調整します。
レーザー装置を取り外し、円錐体と脊髄の間の空間を、気泡を発生させずに脱気超音波ゲルで満たします。トランスデューサーの出力に超音波処理のパラメータを設定します。製造元の指示に従ってマイクロバブル溶液を調製します。
尾静脈カテーテル検査が成功する可能性を高めるには、尾部を温水に浸し、尾部の付け根に止血帯を装着して静脈の直径を大きくします。次に、22ゲージの尾静脈カテーテルを挿入し、0.2ミリリットルのヘパリン化生理食塩水で洗い流します。1キログラムあたり1ミリリットルの3%エバンスブルー染料(EBD)をカテーテルに注入します。
次に、カテーテルを0.2ミリリットルのヘパリン化生理食塩水で洗い流します。ラットの皮膚、目、または背側脊髄静脈の青色の色の変化をチェックして、尾静脈カテーテル検査が成功したことを確認します。超音波処理を開始する前に、0.2ミリリットルのマイクロバブルのボーラスをカテーテルに注入し、ヘパリン処理した生理食塩水で洗い流します。
ラットを安楽死させた後、脊髄を取り除き、摂氏4度の4%パラホルムアルデヒドに一晩置きます。翌日、パラホルムアルデヒドをPBSと交換します。BSCBの破壊を視覚化するには、かみそりの刃を使用して、超音波処理の場所を囲む2センチメートルのセクションを分離します。
ミクロトームを用いて切片を厚さ10ミクロンの切片に分割し、ヘマトキシリンエオシン染色で染色します。蛍光顕微鏡では、脊髄切片を含むスライドを脱パラフィンし、封入剤に溶解した25マイクロリットルのDAPIで対比染色します。白化を防ぐために、切片を摂氏4度で暗所で10分間インキュベートします。
インキュベーション後、蛍光顕微鏡を使用してすべてのスライドを画像化します。ヘマトキシリンとエオシンで染色したスライドを光学顕微鏡で画像化します。脊髄血管系は椎弓切除術後に見え、後部脊髄静脈を示し、複数の小さな血管が横方向に放射状に広がっています。
EBDの静脈内注射後、周囲の組織と脊髄血管系が青色に見えました。超音波処理後、標的位置に青い斑点が見えるようになり、BSCB破壊による白色実質へのEBDの血管外流出を示します。ラットから脊髄を低強度の集束超音波検査、またはLIBU超音波処理で切除すると、脊髄へのEBDの明らかな血管外漏出が確認されました。
一方、LIBU治療を行わないネガティブコントロールラットはEBDの血管外漏出を示さなかった。LIBU超音波処理を受けた脊髄は、超音波処理を受けなかった脊髄よりも有意に高いEBD自家蛍光の強度を示しました。DAPIの強度はほぼ同じです。
ヘマトキシリンおよびエオシン分析では、超音波処理された場所に神経細胞の損傷、出血、または空洞病変は見られませんでした。外科的取り扱いの誤りによる損傷した臍帯の例、および高出力超音波処理が比較として示されています。マイクロバブルおよびLIBU処理を受けたラットでは、運動スコア、超音波処理前、超音波処理後、および5日間の生存期間中に変化は観察されなかった。
超音波処理分析の前、最中、および後に脊髄温度の最小限の変化が観察されました。椎弓切除術中の臍帯への外科的損傷を制限することが重要です。HとEの染色切片を顕微鏡で可視化することで、損傷が発生しているかどうかがわかります。
血液-脊髄関門破壊後、焦点式超音波を使用して、動物に抗腫瘍剤または遺伝子療法を注射することができます。結果は、この技術が治療薬の送達を改善し、脊髄病理学の設定における生存期間を延長できるかどうかを決定します。
