このプロトコルは、CRISPR-Cas9 を使用して、ノックアウトまたはノックインラインを作成します。この技術の主な利点は、特に初心者の研究者のために従うことは簡単で効率的です。細胞通過の場合、1皿当たり0.25%トリプシンEDTAの2ミリリットルの一晩培養細胞を摂氏37度で2分間治療する。
細胞がプレート底面から持ち上がったら、2ミリリットルの細胞培養培地で酵素反応を中和し、細胞懸濁液を円錐チューブに移す。遠心分離によって細胞を収集し、カウント用の新鮮な細胞培養培地の5ミリリットルでペレットを再懸濁する。その後、摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩培養するための24ウェル組織培養プレートの1つの井戸に1.8倍の5番目の細胞に種をまきます。
細胞のトランスフェクションについては、実験計画および製造業者の指示に従って、CRISPRプラスミドの適切な濃度を含む適切な量のトランスフェクション試薬を適切な量のトランスフェクション試薬に加える。推奨期間室温でトランスフェクションミックスをインキュベーションした後、液をドロップワイズで細胞に加えます。その後、プレートをそっと渦巻いて混合し、5%の二酸化炭素を加湿した37°Cインキュベーターにプレートを入れ、
トランスフェクションの終了時に、150マイクロリットルのトリプシン-EDTAを加えて細胞を解離し、遠心分離によって脱離した細胞を回収します。PBSで2%のウシ胎児血清中のペレットを再懸濁し、30マイクロメートルメッシュストレーナーを介して5ミリリットル蛍光活性化細胞選別、またはFACSチューブに細胞を濾過します。次に、非トランスフェクトされた細胞を使用して、フローサイトメーターに陰性制御ゲートを設定し、細胞培養液の100マイクロリットルを含むチューブにトランスフェクションに使用されるCRISPRプラスミド上の蛍光マーカーに従ってトランスフェクトされた細胞を選別します。
全てのトランスフェクト細胞が採取されると、ペレットは最大速度で遠心分離して細胞をペレット化し、300マイクロリットルの細胞培養培地中でペレットを再懸濁した。24ウェル組織培養プレートの1つの井戸に200マイクロリットルの細胞をシードし、細胞が37°Cインキュベーターで数日間回復することを可能にする。残りの100マイクロリットルの細胞を最高速度で5分間ペレットし、標準的なDNA抽出プロトコルに従って得られたペレットからゲノムDNAを抽出した。
次に、10マイクロリットルのポリメラーゼ連鎖反応バッファー、デオキシヌクレオチドミックス1マイクロリットル、ユーザー定義リバースプライマー2.5マイクロリットル、0.5マイクロリットルのDNAポリメラーゼ、抽出されたゲノムDNAテンプレートの2〜5マイクロリットル、および50マイクロリットルの最終体積に反応をもたらすのに十分な二重蒸留水を加える。サーマルサイクラーで混合物を実行し、標準プロトコルに従って1X TAEバッファーを使用して2%アガロースゲル上の反応を解決します。清潔でシャープなメスを使用してポリメラーゼ連鎖反応物を切除し、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。
260ナノメートルの吸光度で分光光度計を使用して製品の濃度を測定します。200ナノグラムの単離されたDNA、T7エンドヌクレアーゼI反応バッファーの2マイクロリットル、および混合物の最終体積を19マイクロリットルにする十分な二重蒸留水を含むアッセイミックスを準備する。ポリメラーゼ連鎖反応生成物を示されたパラメータでサーマルサイクラーで再膜し、T7エンドヌクレアーゼIの5単位をReanneareled生成物と混合し、摂氏37度で50分間インキュベーションします。
インキュベーションの終了時に、1X TAEバッファーを使用して2.5%アガロースゲル上で消化されたDNAを解決し、適切なゲルイメージングシステム上でゲルを画像化します。ImageJ でゲルイメージを開き、バンドの周囲をできるだけ境界に近い長方形のボックスに描画します。[解析]をクリックし、[測定を設定]をクリックして、面積、平均グレー値、および統合密度オプションがチェックされていることを確認します。
[OK] をクリックし、[分析] を選択して[測定] をクリックします。平均値、または生の強度密度値は、バンド強度を示す値です。培養トランスフェクションされた細胞がコンフルエントになり始めたら、示されているようにトリプシンEDTAで取り外し、細胞を100ミリメートルの組織培養皿にまばらに播種して、細胞を細胞培養器に戻す前に個々のコロニーが成長するのに十分なスペースを確保する。
コロニーが形成し始めると、4つのX倍率の顕微鏡を使用して、ウェルあたり500マイクロリットルの細胞培養培地を含む24ウェルプレートの個々の井戸に移管するために個々のコロニーを選ぶ。あなたの先端は、個々の井戸内のコロニーの混合を防ぐために周囲のコロニーに触れていないか、まばらなコロニーの成長の領域から選ぶように注意してください。すべてのクローンが摘み取られたら、培養物がコンフルエントになるまで細胞培養インキュベーターにプレートを置く。
未消化のプラスミドは超コイル状であるため、線形化されたプラスミドよりも速く走る傾向があります。オリゴヌクレオチドがCRISPRプラスミド骨格に正常にクローン化されたかどうかを判断するために、コロニーPCRが行われ、プラスミドが抽出されてサンガーシーケンシングのために送られる前に陽性クローンが接種されます。この蛍光シグナルは、プラスミドの送達に成功すると顕微鏡下で容易に可視化することができ、トランスフェクトされた細胞をフローサイトメトリーで選別することができます。
T7エンドヌクレアーゼIアッセイは、アガロースゲル上に観察されたバンドの強度から計算されるように、ゲノムDNAの切断効率をチェックするために行われる。さらに、相同性指向の修復ベースの実験が標的遺伝子座に制限部位を組み込むように設計されている場合、制限フラグメント長多型アッセイは、対応する制限酵素を用いて行うことができる。タンパク質コード遺伝子が正常に不活性化されたことをさらに検証するために、ウェスタンブロットを実行して、標的タンパク質が存在しないようにすることができます。
トランスフェクション後に細胞を選別すると、プラスミドを組み込まずに細胞を排除し、ノックアウトまたはノックイン遺伝子を有する細胞として後の段階でスクリーニングされる細胞の割合を増加させる。この技術の開発により、ノックアウト細胞株を作製して遺伝子機能を研究し、細胞株をノックアウトして特定の疾患をモデル化し、そのメカニズムを理解できるようになりました。
