我々は、クレム・ジョーンズAO博士のエステート、オーストラリア国立保健医療研究評議会[GNT1145580、GNT1176326]、金属財団、クイーンズランド州政府(DSITI、科学・情報技術・イノベーション省)の支援を認める。

すべての動物実験は、クイーンズランド大学の動物倫理委員会によって承認された。
1. マイクロバブルの社内準備
<ol><li>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンと1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)のモル比を9:1で計量する。マイクロバブル溶液1mLあたり0.5mgの脂質混合物が必要である。あるいは、脂質はクロロホルムで既に購入することができ、予め溶解した脂質を使用する場合はステップ1.3に進む。</li>
	<li>ガラスビーカー内の少量のクロロホルムに脂質を溶解する。</li>
	<li>クロロホルムをエバポレーターまたは窒素気流で蒸発させる。</li>
	<li>乾燥した脂質膜を、0.22 μm フィルターでろ過した PBS + 10% グリセロール + 10% プロピレングリコール溶液 10 mL で再水和します。</li>
	<li>再水和脂質溶液を55°C(脂質の溶融温度以上)に設定したウォーターバス超音波処理機に入れ、完全に溶解するまで超音波処理する。</li>
	<li>脂質溶液をオートクレーブ処理した1.5mL HPLCバイアルにアリコートし、セプタキャップにねじ込む。</li>
	<li>27G針を備えた5mLシリンジでバイアル内のすべての空気を吸引し、バイアル内に真空を作ります。</li>
	<li>付属のシリンジでオクトフルオロプロパンをバイアルに加え、キャニスターからガスを吸い込みます。シリンジ内の体積を読み取ることによって、バイアルに1〜2mLのオクタフルオロプロパンを充填する。</li>
	<li>各バイアルをパラフィンフィルムで密封し、冷蔵する。</li>
	<li>実験当日、バイアルを室温にし、0.5mLの0.9%NaCl溶液をバイアルに加え、バイアルをアマルガメーターに入れ、45秒(予め設定された時間)攪拌してマイクロバブルを生成させた。</li>
</ol>2. コールターカウンターによるマイクロバブル品質管理
<ol><li>マイクロバブル溶液をアマルガメータから取り出し、セプタを19G針で穿刺してバイアルからガスを排出する。</li>
	<li>19G針付き1mlシリンジを用いて5mLの濾過流動溶液にマイクロバブル溶液100μLを加えて2段階1:5,000段階希釈を行いマイクロバブル溶液を希釈し、次いで1:50希釈マイクロバブル溶液100μLを採取し、ピペットを用いてキュベット内の10mL濾過流動溶液にピペッティングする。</li>
	<li>電解質タンクに十分なフロー溶液があり、廃棄物タンクが空であることを確認してください。</li>
	<li>キュベットをコールターカウンタープラットフォームに置き、所定の位置にロックします。サンプル取得には30μmのアパーチャを使用してください。</li>
	<li>ソフトウェアで、標準操作方法(SOM)をロードし、[ SOM|濃度の編集 ]を選択します。5000倍の希釈率を入力します。</li>
	<li>ソフトウェアで、適切なファイル名を選択します。たとえば、microbubble_1_dateのようにします。</li>
	<li>キュベットをプラットフォームにロードして固定します。</li>
	<li>ソフトウェアで [ 実行] を選択|サンプル 濃度が10%未満であることをプレビューして確認します。この数値が10%より高い場合、より高い希釈倍率でマイクロバブルの新たな希釈を行う。</li>
	<li>「開始」を選択してサンプルの集録を開始し、初期読み出しを取得します。</li>
	<li>各測定後にろ過されたフロー溶液でコールターカウンターの開口部をすすぎます。手順2.2~2.9を繰り返して、3回の反復を取得します。</li>
	<li>超音波処理器の水浴に希釈マイクロバブル溶液とキュベットを置き、30秒間超音波処理します。</li>
	<li>超音波処理されたマイクロバブルで溶液を測定し、ブランクとしてラベルを付けます。</li>
	<li>ソフトウェアで、最初の読み出しから最終的な読み出しを減算します。これにより、マイクロバブルではなく、気体を含まない粒子が差し引かれます。</li>
	<li>ソフトウェアで 結果の表示 を選択し、マイクロバブル濃度、サイズ分布、平均サイズ、体積濃度を表示します。</li>
</ol>3. 蛍光抗体標識
<ol><li>マウス IgG を無添加で PBS 中に 1 mg/mL 溶液で入手します。</li>
	<li>キットにある製造元の指示に従って、マウスIgGを0.1 M重曹緩衝液中のAlexaFluor 647で1 mgのラベル付けします。この量の蛍光標識IgGは、5mg/kg用量の抗体を投与する5〜7匹の成体マウスでこの手順を実行するのに十分である。</li>
	<li>色素を0.1 M重曹緩衝液中のIgGの溶液に加え、室温で15分間インキュベートする。</li>
	<li>蛍光標識抗体を精製するには、抗体溶液をスピンカラムにピペッティングし、1,000 x g で5分間遠心分離します。遊離染料はカラムベッドに残ります。</li>
	<li>分光光度計を使用してタンパク質濃度を測定します。280nmおよび650nmにおけるコンジュゲート溶液の吸光度を測定する(A280およびA650)。次の式を使用して、サンプル中のタンパク質の濃度を計算します。 タンパク質濃度(M)=[A280-(A650 x 0.03)]×希釈倍率/203,000。</li>
	<li>分光光度計を使用して、次の式を使用してラベリングの程度を計算します。 モルタンパク質当たりの色素モル数=A650 x希釈倍率/239 000 xタンパク質濃度(M)。 注:許容可能な標識の程度は、タンパク質1モル当たり3〜7モルの色素であり、典型的には得られる標識の程度は約6である。</li>
</ol>4. 超音波のセットアップ
<ol><li>集束超音波システムを使用して、5mmスペーサーを水ボーラスに追加して、超音波焦点を水ボーラスの底から9mm下方に配置します。</li>
	<li>インライン脱気装置で20分間脱気した約300mLの脱イオン水で水ボーラスを満たします(酸素含有量は3ppm未満でなければなりません)。環状アレイを充填された水ボーラスに入れ、歯科用ミラーを使用して表面に気泡がないことを確認します。表面に存在する場合は、環状アレイを取り外し、水中ボーラスに入れ替えます。</li>
	<li>アプリケーションソフトウェアを起動します。波形メニューで、「 波形デューティサイクルを設定」を選択します。設定はPRF(Hz)10、デューティサイクル10%、フォーカス80mm、中心周波数1MHz、振幅(MPaピーク負圧)0.65MPa、メカニカルインデックス=0.65です。 Set キーを押して波形を定義し、メモリに保存します。 注:集束超音波システムは、校正されたハイドロフォンによって行われた測定値から製造業者によって事前に較正されています。</li>
	<li>集束超音波システムソフトウェアで、治療計画を定義します。これには、複数の個々の治療部位からなる治療領域を定義し、それらの治療部位のそれぞれでとるべきアクションを定義することが必要である。この場合、治療ゾーンはマウス脳の1半球である。</li>
	<li>モーションコントローラウィンドウで、[ スキャン ]タブに移動し、x次元のモーションの開始値、停止値、インクリメント値を入力し、y方向の動きの開始値、停止値、インクリメント値 を入力します 。X: 開始 -4、停止 3.50、Y: -3.00、停止 3、インクリメント 1.5、# ループ: 1 の値を入力します。</li>
	<li>治療部位のアクションを定義します。モーションコントローラウィンドウで、[ イベント ]ボタンを選択します。 スクリプト編集ウィンドウで、各治療部位で選択した順序で実行されるアクションのリストを選択します。スクリプトウィンドウの上部にある [移動タイプ ]をラスターグリッドに設定します。「イベント」タブで 、「アクションの追加」 を選択してスクリプト・パネルに移動し、「 同期的に移動」、「トリガー arb を 開始」、「 待機」、「トリガー arb を停止」 を追加します。待機アクションをクリックし、6, 000 ミリ秒の待機時間を選択します。 注:これらの設定により、治療は1.5 mm間隔で6 x 5グリッドの処理スポットになり、各スポットの治療期間は6秒になります。マウスの脳を超音波処理する総持続時間は約3分です。このサイズの治療グリッドは、体重約30gの成体C57/Bl6マウスに適しています。治療スポットのグリッドのサイズは、マウスのサイズに応じて上下に調整することができます。</li>
</ol>5. 動物の準備
<ol><li>0.1gの正確な天秤でマウスの重量を量ります。</li>
	<li>マウスを腹腔内に90mg / kgケタミンおよび6mg / kgキシラジンで麻酔する。つま先のピンチで反射神経がないかテストします。あるいは、マウスは、適切なフェイスマスクを有する適切な吸入麻酔装置を用いてイソフルランで麻酔することができる。イソフルランを使用する場合は、低体温症を防ぐために超音波検査中にマウスをヒートパッドに置く必要があります。</li>
	<li>電気カミソリを使用して動物の頭から髪を剃り、綿芽で脱毛クリームを塗布し、2〜3分間、または湿ったガーゼで髪をきれいに拭き取るまで放置します。脱毛クリームがマウスの目に入り込まないように注意してください。</li>
	<li>マウスの頭の中心に永久マーカーを付けます。トランスデューサの中心には穴があり、トランスデューサの焦点と焦点を視覚的に位置合わせすることができます。</li>
	<li>以前に底部が切断され、超音波ゲルで計量ボートの底に接着されたプラスチックラップと交換された小さな計量ボートを充填する。これは8mmのスペーサーとして機能し、マウスのヘッドに良好な結合を提供し、マウスのヘッドに合わせた探触子の焦点の目視検査を可能にします。</li>
</ol>6. マイクロバブル調製
<ol><li>マイクロバブルバイアルを室温まで温める。活性化するには、0.5mLの0.9%NaCl溶液をバイアルに加え、アマルガメータに入れて45秒間攪拌してマイクロバブルを生成する。</li>
	<li>セプタを27G針で突き刺してバイアルを通気します。</li>
</ol>7. 超音波治療
<ol><li>マイクロバブルのバイアルを反転させ、1μL/gの体重の溶液を静かに引き出す。これに蛍光標識抗体の溶液を加え、シリンジ内で穏やかに混合する。注入される最大容量は150μLである。 注:社内で調製されたマイクロバブルは、臨床的に使用されているマイクロバブル(例えば、Definityマイクロバブル)よりも約60倍濃度が低い。注入されるマイクロバブルの数が臨床的に使用されているものと類似するように体積または濃度を調整する(すなわち、マイクロバブルの数が臨床的に使用されているものと同様である(すなわち、マイクロバブルの数が臨床的に使用されているものと同様である。定義1.2 x 108 マイクロバブル/ kg体重)。</li>
	<li>マイクロバブルと抗体溶液を眼窩下へ注入し、穏やかでゆっくりと注入するように注意する。次に、マウスの目に眼科用軟膏を塗布する。</li>
	<li>マウスをヘッドホルダー(材料表を参照)に置き、マウスの鼻を固定します。次に、超音波ゲルで満たされた小さな計量ボートを頭の上に置きます。</li>
	<li>計量ボートの超音波ゲルの上に座るまで、水ボーラスを下げます。</li>
	<li>ジョイスティックを使用して、探触子のフォーカスをヘッドの中央に移動します。モーションタブで 「原点をリセット」 を選択します。</li>
	<li>[スキャンの完了] を選択します。手順 7.3 ~ 7.6 の所要時間は 2 分です。</li>
	<li>一貫性を保つために、マイクロバブルの注入から完全スキャンの選択までの間に2分の遅延があるようにタイマーを設定します。</li>
	<li>治療が完了したら、眼科用軟膏を眼に塗布し、マウスを温めた回収チャンバに入れる。処置中に低体温が観察された場合、処置中に補助的な熱を提供するために、加温パッドをマウスの下に置くことができる。</li>
</ol>8. 組織の採取と加工
<ol><li>超音波送達後の関心のある時点(脳内の高レベルの抗体を検出するために少なくとも1時間)に、ペントバルビトン溶液(100mg / kg)の過剰摂取でマウスを深く麻酔し、30mLのPBSでマウスを経心線灌流する。良好な灌流は、脳に送達された蛍光標識抗体を特異的に検出するために必要とされる。</li>
	<li>脳を集め、4%PFAに4°Cで24時間浸漬して固定し、PBSで洗浄する。</li>
	<li>脳をトレイの上に置き、700nmチャンネルの画像を取得することによって、赤外線スキャナで脳を画像化します。 注:固定後、脳をPFAから除去し、PBSで洗浄し、切片化する。あるいは、エチレングリコール凍結保護剤溶液中に4°Cで24時間、または水没するまで入れ、次いで新しい凍結保護剤含有バイアルに移動し、長期保存のために−20°Cで置くことができる。</li>
	<li>ビブラートームを用いてPBSで脳風邪を切開する。脳をプラットフォームに接着し、30〜40μmの切片を切断してPBSに集める。 注:リソソーム自己蛍光(約12ヶ月以上経過した動物からの切片で流行)は、細菌の増殖をブロックするために、室温およびアジド(0.02%)を含むPBS中で、軽いチャンバーボックス内の切片の一晩照明によって漂白されるべきである。</li>
</ol>9. 組織染色と画像取得
<ol><li>切片をブロッキング溶液(0.2%トリトン/PBS中の5%BSA)に室温で2時間移送し、次いで溶液を0.2%トリトン/PBSで置換して切片3xを洗浄する。</li>
	<li>切片を、Iba1(希釈1:1,000)およびCD68(希釈1:500)に対する一次抗体と共に、0.2%Triton/PBS中で一晩4°Cでインキュベートし、続いて0.2%Triton/PBSで3回洗浄する。</li>
	<li>切片を蛍光二次抗体(希釈1:500)で室温で2時間インキュベートし、続いて0.2%Triton/PBSのみで3回洗浄します。 注:核は、DAPI溶液(0.5μg/mL)を使用して染色することもできます。</li>
	<li>切片をスライドとカバースリップに、ハードセットの取り付けメディアで移します。可視化と画像取得の前に(一晩)取り付け媒体が固化するのに十分な時間を確保してください。</li>
	<li>共焦点顕微鏡を用いて、共焦点顕微鏡および少なくとも40倍の倍率の対物レンズを用いて、超音波標的脳領域のzスタック画像(少なくとも10μm深さおよび0.3μmステップサイズ、動物あたり10画像)を得る。 メモ:信号ダイナミックレンジ内の画像を取得するように注意し、露出不足/露出過多を避けてください。顕微鏡で使用される対応するソフトウェア形式で画像ファイルを保存します。</li>
</ol>10. 画像解析
<ol><li>画像解析ソフトウェアのファイルインポーターを使用して、zスタック顕微鏡ファイルを変換します。</li>
	<li>変換したファイルをソフトウェアに開き、Iba1チャネルの強度を調整してミクログリア細胞を観察します。</li>
	<li>単一のミクログリアセルの周りにボックスを描画してトリミングし、「トリミング」を選択して新しいファイルを保存します。</li>
	<li>IBA1 信号の 3D サーフェス レンダリングを作成するには、次の操作を行います。<ol>
<li>前の手順で生成した単一セルの Imaris ファイルを開きます。</li>
		<li>ファイルにサーフェスを追加します。</li>
		<li>Iba1染色に対応するチャネルを選択する。</li>
		<li>Iba1染色と重なるしきい値を適用する</li>
		<li>目的のミクログリア細胞を形成している目的の構造のみを選択する</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロセスの最終決定<ol>
<li>Iba1染色の体積を取得して記録する</li>
		<li>CD68染色の3D表面レンダリングを構築する</li>
		<li>IBA1サーフェスサブファイル内で、CD68チャンネルをマスクし、IBA1染色の外側のボクセルを除去します</li>
		<li>ファイルに新しいサーフェスを追加する</li>
		<li>CD68染色に対応するチャンネルを選択</li>
		<li>CD68染色と重なり、染色量にできるだけ近い閾値を適用する</li>
		<li>このファイルにはミクログリア内CD68構造のみが存在し、したがって、別の閾値フィルタリングステップを必要としないため、プロセスを終了します。</li>
		<li>CD68陽性構造の数と平均体積を取得して記録する</li>
		<li>貪食状態におけるミクログリア活性化の尺度として、対応するIBA1構造当たりのCD68構造の相対体積を計算する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Choi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+and+transient+blood-brain+barrier+opening+in+the+hippocampus+of+Alzheimer's+double+transgenic+mice+using+focused+ultrasound.">Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound.</a> Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).</li><li>Lipsman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+opening+in+Alzheimer's+disease+using+MR-guided+focused+ultrasound.">Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound.</a> Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).</li><li>Pandit, R., Chen, L., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+physiology+and+strategies+for+drug+delivery.">The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Pathogenesis+of+the+Tauopathies.">Molecular Pathogenesis of the Tauopathies.</a> Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).</li><li>Pandit, R., Leinenga, G., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+ultrasound+treatment+of+tau+transgenic+mice+clears+neuronal+tau+by+autophagy+and+improves+behavioral+functions.">Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions.</a> Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).</li><li>Karakatsani, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Focused+Ultrasound-Induced+Blood-Brain+Barrier+Opening+Reduces+Phosphorylated+Tau+from+The+rTg4510+Mouse+Model.">Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model.</a> Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).</li><li>Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+Diffusion+of+Macromolecule+Delivery+to+the+Brain+via+Focused+Ultrasound+using+Magnetic+Resonance+and+Multispectral+Fluorescence+Imaging.">Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).</li></ol>

開示するものは何もありません。

蛍光標識抗体は、走査モードで適用されるマイクロバブルと共に集束超音波を使用して脳に送達することができる。抗体送達、ミクログリア形態およびリソソーム拡大は、走査型超音波に続く蛍光顕微鏡によって検出することができる。ミクログリアは、Fc受容体媒介プロセスにおいて抗体と抗体が結合した抗原をリソソームに取り込むことができます4。
<p class="jove_conte...

治療用超音波は、脳への治療薬のアクセスを容易にすることによって、非侵襲的な方法で脳疾患を治療することを目的とした新興技術です1,2,3。脳疾患を標的とする治療用抗体のごく一部のみが脳に取り込まれ、脳内に保持されるため4、治療用超音波は、その取り込みと標的エンゲージメントを高める可能性を提供します5,6。
当研究室では、マイクロバブルを用いて血液脳関門(BBB)を介して様々な形態の抗体を送達する神経変性疾患の治療アプローチを開発しています。これを達成するために、超音波は、我々が走査超音波(SUS)7と呼ぶ走査モードを使用して、頭蓋骨を通って脳に複数のスポットで適用される。超音波エネルギー、静脈内注入されたマイクロバブルおよび脳血管系との間の機械的相互作用は、所与の超音波処理体積におけるBBBのタイトジャンクションを一過性に分離し、抗体および治療薬を含む他の貨物がこの障壁を効果的に通過することを可能にする7,8,9.さらに、超音波は、間質性脳からニューロンなどの脳細胞への抗体の取り込みを容易にし、抗体が細胞体全体および神経炎プロセスにさえ分布することが示されている5,10。
アルツハイマー病はアミロイドβとタウの病理11によって特徴付けられ、病原性メカニズムを解剖し、治療戦略を検証するために多数の動物モデルが利用可能です。超音波を脳全体に逐次パターンで適用するSUSアプローチを数回の治療セッションにわたって繰り返すと、アミロイドβ沈着アミロイド前駆体タンパク質(APP)変異マウスの脳内のアミロイドプラーク病理を軽減し、アミロイドを取り込むミクログリアを活性化し、認知機能の改善につながります7。超音波およびマイクロバブルによるBBB開口部はまた、pR5、K3およびrTg4510タウトランスジェニックマウスにおけるタウ病理を減少させる5,12,13。重要なことに、ミクログリアは細胞外タンパク質沈着物を除去するが、SUSによって誘導されるニューロン内病理の根底にあるクリアランスメカニズムの1つは、ニューロンオートファジーの活性化である12。
ここでは、蛍光標識抗体を調製し、社内の脂質ベースのマイクロバブルと混合した後、麻酔をかけたマウスに眼窩後注射する実験プロセスを概説する。眼窩後注射は尾静脈注射の代替であり、同様に効果的で繰り返し行う方が簡単であることがわかっています。これに続いて、SUSを脳に適用します。治療用抗体の取り込みを決定するために、マウスを屠殺し、脳内の増加した抗体濃度を定量化する。脳恒常性の変化の代理として、ミクログリア貪食活性は、組織学および体積3D再構成によって決定される。
生成されたデータは、抗体の超音波送達が神経変性疾患を治療するための潜在的に魅力的なアプローチであることを示唆している。このプロトコルは、他の医薬品候補や、定義されたサイズの蛍光標識されたデキストランなどのモデル貨物にも同様に適用できます14。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880128C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 antibody labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A20186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 antibody</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1957GA</td>
			<td>Use 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter (Multisizer 4e)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>Use 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>head holder (model SG-4N, Narishige Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Use 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>#8547008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflow flow solution</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared imaging system Odyssey Fc</td>
			<td>Licor</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octafluoropropane</td>
			<td>Arcadophta</td>
			<td>0229NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIPS (Therapy Imaging Probe System)</td>
			<td>Philips Research</td>
			<td>TIPS_007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of antibodies into the brain using focused scanning ultrasound

脳疾患を標的とする抗体医薬のごく一部のみが脳に取り込まれます。集束超音波は、血液脳関門(BBB)の一時的な開放を介して抗体の取り込みおよび関与を増加させる可能性を提供する。当研究室では、複数の部位を標的とした頭蓋骨を標的とした集束超音波の適用と併せて、マイクロバブルを用いてBBB全体に様々な形態の抗体を送達する神経変性疾患の治療アプローチを開発しています。血管に対するマイクロバブルおよび超音波の機械的効果は、タイトジャンクションを一時的に分離することによってBBBを横切る傍細胞輸送を増加させ、小胞媒介性トランスサイトーシスを増強し、抗体および治療剤が効果的に交差することを可能にする。さらに、超音波はまた、抗体が細胞体全体に分布するニューロンなどの脳細胞への間質脳からの抗体の取り込みを容易にし、さらには神経炎プロセスにも促進する。本研究では、蛍光標識抗体を調製し、自社で調製した脂質ベースのマイクロバブルと混合し、SUSを脳に塗布する直前にマウスに注射します。その後、脳内の抗体濃度の増加が定量化されます。正常な脳恒常性の変化を説明するために、ミクログリア貪食作用を細胞マーカーとして使用することができる。生成されたデータは、抗体の超音波送達が神経変性疾患を治療するための魅力的なアプローチであることを示唆している。

このプロトコールを用いて、蛍光標識抗体が脳に送達され、ミクログリア活性化とともに検出することができる。引き出すことができる結論は、集束超音波およびマイクロバブルの使用が抗体の脳取り込みを著しく増強し、スキャンモードで使用するとマウスの脳全体または半球に抗体を送達することができることである。 図1 は、BBBを開くために使用されるTIPS超音波...

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Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

ここでは、血液脳関門(BBB)を葉状またはマウス脳全体に一過性に開放して蛍光標識抗体を送達し、ミクログリアを活性化するプロトコルを紹介します。また、組織学による抗体の送達およびミクログリア活性化を検出する方法も提示される。

集束走査超音波を用いた脳への抗体の送達

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.0K ビュー.  The University of Queensland. ここでは、血液脳関門(BBB)を葉状またはマウス脳全体に一過性に開放して蛍光標識抗体を送達し、ミクログリアを活性化するプロトコルを紹介します。また、組織学による抗体の送達およびミクログリア活性化を検出する方法も提示される。

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

神経科学

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

CNSへの標的化物質送達のためのマウス顕微注入法<i&gt;経由で</i&gt;内頸動脈

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an approach provides a safe delivery method by-passing the blood brain barrier (BBB), thus allowing treatment with therapeutics with poor BBB-permeability or those for which systemic exposure is not desired, e.g., due to toxicity. CED requires optimization of the catheter design, injection protocol, and properties of the infusate. With this protocol we describe how to perform CED of a solution containing up to 20 &#181;g of an antibody into the caudate putamen of mice. It describes preparation of step catheters, testing them in vitro and performing the CED in mice using a ramping injection program. The protocol can be readily adjusted for other infusion volumes and can be used for injecting various tracers or pharmacologically active or inactive substances, including chemotherapeutics, cytokines, viral particles, and liposomes.

Convection-enhanced delivery (CED) is a method enabling effective delivery of therapeutics into the brain by direct perfusion of large tissue volumes. The procedure requires the use of catheters and an optimized injection procedure. This protocol describes a methodology for CED of an antibody into a mouse brain.

対流強化送達によるマウス脳への抗体の送達

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

ラットモデルにおける集中超音波を用いた位置特異的血液脳関門開口へのベンチトップアプローチ

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

脳回路の非侵襲的切断に対する標的ニューロン損傷

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...