Wir danken der Unterstützung durch den Nachlass von Dr. Clem Jones AO, dem National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], der Metal Foundation und der Regierung des Bundesstaates Queensland (DSITI, Department of Science, Information Technology and Innovation).

Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der University of Queensland genehmigt.
1. Eigene Mikroblasenaufbereitung
<ol><li>Wiegen Sie ein 9:1 molares Verhältnis von 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino(Polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) ab. Pro 1 ml Mikroblasenlösung werden 0,5 mg Lipidmischung benötigt. Alternativ können Lipide bereits in Chloroform gekauft werden, wenn mit vorgelösten Lipiden mit Schritt 1.3 fortgefahren wird.</li>
	<li>Lösen Sie das Lipid in einem kleinen Volumen Chloroform in einem Glasbecherglas auf.</li>
	<li>Verdampfen Sie das Chloroform mit einem Verdampfer oder einem Stickstoffstrom.</li>
	<li>Rehydrieren Sie den getrockneten Lipidfilm mit 10 ml PBS + 10% Glycerin + 10% Propylenglykollösung, die durch einen 0,22-μm-Filter gefiltert wurde.</li>
	<li>Die rehydrierte Lipidlösung in einen auf 55 °C eingestellten Wasserbadbeschaller (über der Schmelztemperatur der Lipide) geben und bis zur vollständigen Auflösung beschallen.</li>
	<li>Aliquot-Lipidlösung in autoklavierte 1,5-ml-HPLC-Fläschchen und Schrauben Sie die Septakappen auf.</li>
	<li>Saugen Sie die gesamte Luft in der Durchstechflasche mit einer 5-ml-Spritze ab, die mit einer 27-G-Nadel ausgestattet ist, und erzeugen Sie ein Vakuum in der Durchstechflasche.</li>
	<li>Fügen Sie Octofluorpropan mit der mitgelieferten Spritze in die Durchstechflasche ein und ziehen Sie das Gas aus dem Kanister an. Füllen Sie die Durchstechflasche mit 1-2 ml Octafluorpropan, indem Sie das Volumen in der Spritze ablesen.</li>
	<li>Verschließen Sie jede Durchstechflasche mit Paraffinfolie und kühlen Sie sie ab.</li>
	<li>Am Tag des Experiments bringen Sie die Durchstechflasche auf Raumtemperatur, geben Sie 0,5 ml 0,9% NaCl-Lösung in die Durchstechflasche, legen Sie die Durchstechflasche dann in einen Amalgamator und rühren Sie für 45 s (voreingestellte Zeit), um die Mikroblasen zu erzeugen.</li>
</ol>2. Mikroblasen-Qualitätskontrolle mit einem Scharzähler
<ol><li>Nehmen Sie die Mikroblasenlösung aus dem Amalgamator und entlüften Sie das Gas aus der Durchstechflasche, indem Sie die Septen mit einer 19-G-Nadel durchstechen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Mikroblasenlösung, indem Sie zweistufige serielle Verdünnungen von 1:5.000 durchführen, indem Sie 100 μL Mikroblasenlösung in 5 ml gefilterte Durchflusslösung mit einer 1-ml-Spritze mit 19-G-Nadel geben und dann 100 μL 1:50 verdünnte Mikroblasenlösung nehmen und mit einer Pipette in eine 10 ml gefilterte Durchflusslösung in einer Küvette pipettieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob der Elektrolyttank über eine ausreichende Durchflusslösung verfügt und ob der Abfallbehälter leer ist.</li>
	<li>Legen Sie die Küvette in die Scharzählerplattform und verriegeln Sie sie. Verwenden Sie eine Öffnung von 30 μm für die Probenaufnahme.</li>
	<li>Laden Sie in der Software die Standardarbeitsmethode (SOM) und wählen Sie dann SOM bearbeiten | Konzentration. Geben Sie die 5000x-Verdünnung ein.</li>
	<li>Wählen Sie in der Software einen geeigneten Dateinamen aus. Beispiel: microbubble_1_date.</li>
	<li>Laden und befestigen Sie die Küvette in der Plattform.</li>
	<li>Wählen Sie in der Software Ausführen aus| Zeigen Sie eine Vorschau an und überprüfen Sie, ob die Stichprobenkonzentration weniger als 10 % beträgt. Wenn diese Zahl höher als 10% ist, führen Sie eine neue Verdünnung der Mikroblasen mit einem höheren Verdünnungsfaktor durch.</li>
	<li>Wählen Sie "Start", um mit der Erfassung der Probe zu beginnen und die erste Anzeige zu erhalten.</li>
	<li>Spülen Sie die Blende des Scharzählers nach jeder Messung mit gefilterter Durchflusslösung ab. Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.9, um 3 Replikate zu erhalten.</li>
	<li>Legen Sie eine Küvette mit verdünnter Mikroblasenlösung in ein Ultraschallwasserbad und beschallen Sie für 30 s.</li>
	<li>Messen Sie die Lösung mit beschallten Mikroblasen und beschriften Sie sie als leer.</li>
	<li>Subtrahieren Sie in der Software die endgültige Anzeige von der anfänglichen Anzeige. Dadurch werden alle Partikel abgezogen, die keine Mikroblasen sind und kein Gas enthalten.</li>
	<li>Wählen Sie in der Software Ergebnisse anzeigen aus, um die Mikroblasenkonzentration, die Größenverteilung, die Durchschnittsgröße und die Volumenkonzentration anzuzeigen.</li>
</ol>3. Markierung fluoreszierender Antikörper
<ol><li>Erhalten Sie eine 1 mg / ml Lösung von Maus-IgG in PBS ohne Zusatzstoffe.</li>
	<li>Beschriften Sie 1 mg Maus-IgG mit AlexaFluor 647 in 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer, indem Sie die Anweisungen des Herstellers im Kit befolgen. Diese Menge an fluoreszierend markiertem IgG reicht aus, um dieses Verfahren an 5-7 erwachsenen Mäusen durchzuführen, bei denen eine Dosis von 5 mg/kg Antikörper verabreicht wird.</li>
	<li>Fügen Sie den Farbstoff der Lösung von IgG in 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer hinzu und inkubieren Sie für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Reinigen Sie den fluoreszierend markierten Antikörper, indem Sie die Antikörperlösung in eine Schleudersäule pipettieren und bei 1.000 x g für 5 min zentrifugieren. Freier Farbstoff verbleibt im Säulenbett.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Proteinkonzentration zu messen. Messen Sie die Absorption der konjugierten Lösung bei 280 nm und 650 nm (A280 und A650). Berechnen Sie die Proteinkonzentration in der Probe unter Verwendung der Gleichung: Proteinkonzentration (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x Verdünnungsfaktor / 203.000.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um den Grad der Beschriftung anhand der Gleichung zu berechnen: Mol Farbstoff pro Mol Protein = A650 x Verdünnungsfaktor / 239 000 x Proteinkonzentration (M). HINWEIS: Ein akzeptabler Markierungsgrad beträgt 3-7 Mol Farbstoff pro Mol-Protein und typischerweise liegt der erhaltene Markierungsgrad bei etwa 6.</li>
</ol>4. Ultraschall-Setup
<ol><li>Verwenden Sie das fokussierte Ultraschallsystem, fügen Sie den 5-mm-Abstandshalter zum Wasserbolus hinzu, um den Ultraschallfokus 9 mm unter dem Boden des Wasserbolus zu positionieren.</li>
	<li>Füllen Sie den Wasserbolus mit ca. 300 ml entionisiertem Wasser, das 20 Minuten lang mit einem Inline-Entgaser entgast wurde (der Sauerstoffgehalt sollte unter 3 ppm liegen). Legen Sie das ringförmige Array in den gefüllten Wasserbolus und verwenden Sie einen Zahnspiegel, um zu überprüfen, ob sich keine Luftblasen auf der Oberfläche befinden. Wenn auf der Oberfläche vorhanden, entfernen Sie das ringförmige Array und ersetzen Sie es im Wasserbolus.</li>
	<li>Starten Sie die Anwendungssoftware. Wählen Sie im Wellenformmenü die Option Wellenform-Tastverhältnis einstellen aus. Die Einstellungen sind PRF (Hz) 10, Tastverhältnis 10%, Fokus 80 mm, Mittenfrequenz 1 MHz, Amplitude (MPa-Spitzenunterdruck) 0,65 MPa, mechanischer Index = 0,65. Drücken Sie Festlegen , um die Wellenform zu definieren und im Speicher zu speichern. HINWEIS: Das fokussierte Ultraschallsystem wird vom Hersteller anhand von Messungen eines kalibrierten Hydrophons vorkalibriert.</li>
	<li>Definieren Sie in der fokussierten Ultraschallsystemsoftware einen Behandlungsplan. Dies erfordert die Definition einer Behandlungsregion, die aus mehreren einzelnen Behandlungsstellen besteht, und die Definition von Maßnahmen, die an jeder dieser Behandlungsstellen zu ergreifen sind. In diesem Fall ist die Behandlungszone eine Hemisphäre des Mäusegehirns.</li>
	<li>Wechseln Sie im Fenster des Motion Controllers zur Registerkarte Scan und geben Sie den Start-, Stopp- und Inkrementwert für die Bewegung in der x-Dimension sowie den Start-, Stopp- und Inkrementwert für die Bewegung in y-Richtung ein. Geben Sie Werte für X ein: start -4, stop 3.50 und Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.</li>
	<li>Definieren Sie die Aktionen für Behandlungsstellen. Wählen Sie im Motion-Controller-Fenster die Schaltfläche Ereignis aus. Wählen Sie im Fenster Skriptbearbeitung eine Liste von Aktionen aus, die in der an jedem Behandlungsort ausgewählten Reihenfolge ausgeführt werden. Legen Sie "Bewegungstyp " oben im Skriptfenster auf das Rasterraster fest. Wählen Sie auf der Registerkarte Ereignisse Aktionen hinzufügen , um sie in das Skriptfenster zu verschieben, und fügen Sie Synchron bewegen, Trigger arb starten , warten, Trigger arb stoppen hinzu. Klicken Sie auf die Warteaktion und wählen Sie eine Wartezeit von 6.000 ms. HINWEIS: Diese Einstellungen machen die Behandlung zu einem 6 x 5-Raster von Behandlungspunkten, die 1,5 mm voneinander entfernt sind, wobei jeder Spot eine Behandlungsdauer von 6 s hat. Die Gesamtdauer für die Beschallung eines Mausgehirns beträgt ca. 3 min. Dieses Behandlungsgitter ist für erwachsene C57/Bl6-Mäuse mit einem Gewicht von ca. 30 g geeignet. Die Größe des Rasters der Behandlungspunkte kann je nach Größe der Maus nach oben oder unten eingestellt werden.</li>
</ol>5. Tierpräparation
<ol><li>Wiegen Sie die Maus mit einer Waage von genau 0,1 g.</li>
	<li>Betäuben Sie die Maus mit 90 mg/kg Ketamin und 6 mg/kg Xylazin intraperitoneal. Testen Sie das Fehlen von Reflexen mit einer Zehenklemme. Alternativ können Mäuse mit einem geeigneten inhalativen Anästhesiegerät mit einer geeigneten Gesichtsmaske mit Isofluran betäubt werden. Bei Verwendung von Isofluran sollte die Maus während des Ultraschalls auf ein Wärmekissen gelegt werden, um Unterkühlung zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer, um das Haar vom Kopf des Tieres zu rasieren, tragen Sie dann Haarentfernungscreme mit einem Wattestäbchen auf, lassen Sie es 2-3 Minuten einwirken oder bis das Haar mit einem feuchten Stück Gaze abgewischt ist. Achten Sie darauf, dass die Haarentfernungscreme nicht in die Augen der Maus gelangt.</li>
	<li>Markieren Sie die Mitte des Mauskopfes mit einem Permanentmarker. Der Wandler hat ein Loch in seiner Mitte und der Fokus und der Brennpunkt des Wandlers können visuell ausgerichtet werden.</li>
	<li>Füllen Sie ein kleines Wägeboot, bei dem zuvor der Boden abgeschnitten und durch Plastikfolie ersetzt wurde, die mit Ultraschallgel auf den Boden des Wägeboots geklebt wurde. Dieser dient als 8 mm Abstandshalter und bietet eine gute Kopplung an den Kopf der Maus und ermöglicht eine visuelle Inspektion des Fokus des Wandlers, der mit dem Kopf der Maus ausgerichtet ist.</li>
</ol>6. Mikroblasen-Vorbereitung
<ol><li>Erwärmen Sie ein Mikroblasenfläschchen auf Raumtemperatur. Zur Aktivierung 0,5 ml 0,9%ige NaCl-Lösung in die Durchstechflasche geben und in einen Amalgamator geben, um 45 s zu rühren, um die Mikroblasen zu erzeugen.</li>
	<li>Entlüften Sie die Durchstechflasche, indem Sie die Septen mit einer 27-G-Nadel durchstechen.</li>
</ol>7. Ultraschallbehandlung
<ol><li>Kehren Sie die Durchstechflasche mit Mikroblasen um und ziehen Sie vorsichtig 1 μL/g Körpergewicht der Lösung auf. Dazu fügen Sie Lösung eines fluoreszierend markierten Antikörpers hinzu und mischen Sie vorsichtig in die Spritze. Das maximale eingespritzte Volumen beträgt 150 μL. HINWEIS: Selbst hergestellte Mikrobläschen sind etwa 60-mal weniger konzentriert als die klinisch verwendeten (z. B. Definity-Mikroblasen). Passen Sie das Volumen oder die Konzentration so an, dass die Anzahl der injizierten Mikrobläschen denen der klinisch verwendeten ähnlich ist (dh. Definity 1,2 x 108 Mikroblasen/kg Körpergewicht).</li>
	<li>Injizieren Sie die Mikroblase und die Antikörperlösung retroorbital und achten Sie darauf, vorsichtig und langsam zu injizieren. Tragen Sie dann die Augensalbe der Maus auf.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in den Kopfhalter (siehe Materialtabelle) und fixieren Sie die Nase der Maus. Legen Sie dann das mit Ultraschallgel gefüllte kleine Wägeboot auf den Kopf.</li>
	<li>Senken Sie den Wasserbolus, bis er auf dem Ultraschallgel im Wiegeboot sitzt.</li>
	<li>Verwenden Sie den Joystick, um den Fokus des Wandlers in die Mitte des Kopfes zu bewegen. Wählen Sie auf der Registerkarte " Bewegung" die Option "Ursprung zurücksetzen ".</li>
	<li>Wählen Sie Scan abschließen aus. Die Schritte 7.3-7.6 dauern 2 Minuten.</li>
	<li>Stellen Sie aus Konsistenzgründen einen Timer ein, um eine Verzögerung von 2 Minuten zwischen dem Einspritzen von Mikroblasen und der Auswahl des vollständigen Scans zu gewährleisten.</li>
	<li>Nachdem die Behandlung abgeschlossen ist, tragen Sie die Augensalbe auf die Augen auf und legen Sie die Maus in eine erwärmte Erholungskammer. Wenn während des Eingriffs eine Unterkühlung beobachtet wird, kann ein Wärmekissen unter die Maus gelegt werden, um während des Eingriffs zusätzliche Wärme bereitzustellen.</li>
</ol>8. Gewebegewinnung und -verarbeitung
<ol><li>Zum Zeitpunkt des Interesses nach Ultraschallabgabe (mindestens 1 h zum Nachweis hoher Antikörperspiegel im Gehirn) die Maus mit einer Überdosierung von Pentobarbiton-Lösung (100 mg/kg) tief betäuben und die Maus mit 30 ml PBS transkardial durchbluten. Eine gute Perfusion ist erforderlich, um spezifisch fluoreszenzmarkierte Antikörper nachzuweisen, die an das Gehirn abgegeben wurden.</li>
	<li>Sammeln Sie das Gehirn und fixieren Sie es durch Eintauchen in 4% PFA für 24 h bei 4 ° C, dann waschen Sie es mit PBS.</li>
	<li>Stellen Sie sich das Gehirn in einem Infrarotscanner vor, indem Sie das Gehirn auf das Fach legen und ein Bild im 700-nm-Kanal aufnehmen. HINWEIS: Nach der Fixierung wird das Gehirn aus der PFA entfernt, in PBS gewaschen und geschnitten. Alternativ kann es in Ethylenglykol-Kryoprotektionslösung für 24 h bei 4 °C oder bis zum Untertauchen gegeben und dann in eine neue Kryoprotektionsmittel-enthaltende Durchstechflasche gegeben und bei -20 °C zur Langzeitlagerung platziert werden.</li>
	<li>Schneiden Sie die Gehirnerkältung in PBS mit einem Vibratom ab. Kleben Sie das Gehirn auf die Plattform und schneiden Sie 30-40 μm-Abschnitte und sammeln Sie sie in PBS. HINWEIS: Lysosomale Autofluoreszenz (vorherrschend in Abschnitten von Tieren, die älter als etwa 12 Monate sind) sollte durch Nachtbeleuchtung der Abschnitte in einer Lichtkammerbox, bei Raumtemperatur und in PBS, das Azid (0,02%) enthält, gebleicht werden, um das Bakterienwachstum zu blockieren.</li>
</ol>9. Gewebefärbung und Bildaufnahme
<ol><li>Übertragen Sie Abschnitte für 2 h bei Raumtemperatur auf Blocklösung (5% BSA in 0,2% Triton/PBS) und waschen Sie dann die Abschnitte 3x, indem Sie die Lösung durch 0,2% Triton/PBS ersetzen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Abschnitte bei 4 °C über Nacht mit den primären Antikörpern gegen Iba1 (Verdünnung 1:1.000) und CD68 (Verdünnung 1:500), in 0,2% Triton/PBS, gefolgt von 3x Waschungen mit 0,2% Triton/PBS.</li>
	<li>Inkubationsabschnitte für 2 h bei Raumtemperatur mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern (Verdünnung 1:500), gefolgt von 3x Wäschen mit nur 0,2% Triton/PBS. HINWEIS: Die Kerne können auch mit DAPI-Lösung (0,5 μg/ml) gefärbt werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Abschnitte mit fest eingestellten Montagemedien auf einen Schlitten und ein Deckglas. Lassen Sie dem Montagemedium ausreichend Zeit, um sich vor der Visualisierung und Bildaufnahme (über Nacht) zu verfestigen.</li>
	<li>Mit einem konfokalen Mikroskop erhalten Z-Stack-Bilder (mindestens 10 μm Tiefe und 0,3 μm Schrittgröße, 10 Bilder pro Tier) des Ultraschall-Zielhirnbereichs unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops und eines Objektivs von mindestens 40-facher Vergrößerung. HINWEIS: Achten Sie darauf, Bilder innerhalb des Signaldynamikbereichs aufzunehmen, um Unter-/Überbelichtung zu vermeiden. Speichern Sie die Bilddateien im entsprechenden Softwareformat, das vom Mikroskop verwendet wird.</li>
</ol>10. Bildanalyse
<ol><li>Konvertieren Sie die z-stack-Mikroskopiedateien mit dem Bildanalyse-Software-Dateiimporter.</li>
	<li>Öffnen Sie die konvertierten Dateien in der Software und passen Sie die Intensität des Iba1-Kanals an, um Mikrogliazellen zu beobachten.</li>
	<li>Schneiden Sie eine einzelne Mikrogliazelle zu, indem Sie eine Box um sie herum zeichnen, wählen Sie "Zuschneiden" und speichern Sie die neue Datei.</li>
	<li>Erstellen Sie das 3D-Oberflächenrendering des IBA1-Signals durch:<ol>
<li>Öffnen Sie die im vorherigen Schritt generierte Imaris-Datei mit einer einzelnen Zelle.</li>
		<li>Fügen Sie der Datei eine Oberfläche hinzu.</li>
		<li>Wählen Sie den Kanal aus, der der Iba1-Färbung entspricht.</li>
		<li>Anwenden eines Schwellenwerts, der die Iba1-Färbung überlappen sollte</li>
		<li>Wählen Sie nur die Struktur von Interesse, die die interessierende Mikrogliazelle bildet</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abschließen des Prozesses<ol>
<li>Abrufen und Aufzeichnen des Volumens der Iba1-Färbung</li>
		<li>Erstellen des 3D-Oberflächen-Renderings der CD68-Färbung</li>
		<li>Maskieren Sie innerhalb der IBA1-Oberflächenunterdatei den CD68-Kanal und entfernen Sie die Voxel außerhalb der IBA1-Färbung</li>
		<li>Hinzufügen einer neuen Oberfläche zur Datei</li>
		<li>Wählen Sie den Kanal, der der CD68-Färbung entspricht</li>
		<li>Wenden Sie einen Schwellenwert an, der die CD68-Färbung überlappen sollte und so genau wie möglich mit den Färbevolumina übereinstimmt.</li>
		<li>Schließen Sie den Prozess ab, da nur die intramikroglialen CD68-Strukturen in dieser Datei vorhanden sind und daher kein weiterer Schwellenwertfilterschritt erforderlich ist</li>
		<li>Ermitteln und Aufzeichnen der Anzahl und des durchschnittlichen Volumens der CD68-Positivstrukturen</li>
		<li>Berechnen Sie das relative Volumen von CD68-Strukturen gemäß den entsprechenden IBA1-Strukturen als Maß für die Mikrogliaaktivierung in einem phagozytischen Zustand.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Choi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+and+transient+blood-brain+barrier+opening+in+the+hippocampus+of+Alzheimer's+double+transgenic+mice+using+focused+ultrasound.">Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound.</a> Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).</li><li>Lipsman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+opening+in+Alzheimer's+disease+using+MR-guided+focused+ultrasound.">Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound.</a> Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).</li><li>Pandit, R., Chen, L., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+physiology+and+strategies+for+drug+delivery.">The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Focused+Ultrasound-Induced+Blood-Brain+Barrier+Opening+Reduces+Phosphorylated+Tau+from+The+rTg4510+Mouse+Model.">Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model.</a> Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).</li><li>Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+Diffusion+of+Macromolecule+Delivery+to+the+Brain+via+Focused+Ultrasound+using+Magnetic+Resonance+and+Multispectral+Fluorescence+Imaging.">Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).</li></ol>

Wir haben nichts offenzulegen.

Fluoreszenzmarkierte Antikörper können mit fokussiertem Ultraschall zusammen mit Mikrobläschen, die in einem Scanning-Modus angewendet werden, an das Gehirn abgegeben werden. Antikörperabgabe, Mikrogliamorphologie und lysosomale Vergrößerung können durch Fluoreszenzmikroskopie nach Rasterultraschall nachgewiesen werden. Mikroglia können in ihren Lysosomen Antikörper und Antigene aufnehmen, an die die Antikörper in einem Fc-Rezeptor-vermittelten Prozess gebunden sind4.
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Therapeutischer Ultraschall ist eine aufstrebende Technologie, die darauf abzielt, Hirnerkrankungen auf nichtinvasive Weise zu behandeln, zum Teil durch Erleichterung des Zugangs von Therapeutika zum Gehirn1,2,3. Da nur ein kleiner Teil der therapeutischen Antikörper, die auf Hirnerkrankungen abzielen, vom Gehirn aufgenommen und im Gehirn zurückgehalten werden4, bietet therapeutischer Ultraschall die Möglichkeit, ihre Aufnahme und ihr gezieltes Engagement zu erhöhen5,6.
In unserem Labor entwickeln wir Therapieansätze für neurodegenerative Erkrankungen, bei denen ein Antikörper in verschiedenen Formaten mittels Mikrobläschen über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) abgegeben wird. Um dies zu erreichen, wird Ultraschall durch den Schädel an mehreren Stellen in das Gehirn angewendet, wobei ein Scanning-Modus verwendet wird, den wir als Scanning-Ultraschall (SUS) bezeichnen7. Die mechanische Wechselwirkung zwischen der Ultraschallenergie, den intravenös injizierten Mikrobläschen und dem Gefäßsystem des Gehirns trennt vorübergehend die Engstellen der BHS in einem gegebenen Beschallungsvolumen, so dass Antikörper und andere Ladungen, einschließlich therapeutischer Wirkstoffe, diese Barriere effektiv überwinden können7,8,9 . Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Ultraschall die Aufnahme von Antikörpern aus dem interstitiellen Gehirn in Gehirnzellen wie Neuronen erleichtert, wo sich der Antikörper im gesamten Zellkörper und sogar in neuritischen Prozessen verteilt5,10.
Die Alzheimer-Krankheit ist durch eine Amyloid-β- und Tau-Pathologie gekennzeichnet11, und eine Vielzahl von Tiermodellen steht zur Verfügung, um pathogene Mechanismen zu sezieren und therapeutische Strategien zu validieren. Ein SUS-Ansatz, bei dem Ultraschall in einem sequentiellen Muster über das gesamte Gehirn angewendet wird, kann, wenn er über mehrere Behandlungssitzungen wiederholt wird, die Amyloid-Plaque-Pathologie im Gehirn von Amyloid-β-ablagernden Amyloid-Vorläuferprotein-mutierten Mäusen (APP) reduzieren und Mikroglia aktivieren, die das Amyloid aufnehmen, was zu einer Verbesserung der kognitiven Funktion führt7. Die BBB-Öffnung mit Ultraschall und Mikroblasen reduziert auch die Tau-Pathologie bei pR5, K3 und rTg4510 tau-transgenen Mäusen5,12,13. Während Mikroglia extrazelluläre Proteinablagerungen entfernen, ist einer der zugrunde liegenden Clearance-Mechanismen für intraneuronale Pathologien, die durch SUS induziert werden, die Aktivierung der neuronalen Autophagie12.
Hier skizzieren wir einen experimentellen Prozess, bei dem fluoreszierend markierte Antikörper hergestellt und dann mit hauseigenen lipidbasierten Mikrobläschen gemischt werden, gefolgt von einer retroorbitalen Injektion in anästhesierte Mäuse. Die retroorbitale Injektion ist eine Alternative zur Schwanzveneninjektion, die sich als ebenso wirksam und einfacher erwiesen hat, wiederholt durchzuführen. Unmittelbar danach wird SUS auf das Gehirn angewendet. Um die therapeutische Antikörperaufnahme zu bestimmen, werden Mäuse geopfert und die erhöhte Antikörperkonzentration im Gehirn anschließend quantifiziert. Als Stellvertreter für die Veränderung der Homöostase des Gehirns wird die mikrogliale phagozytäre Aktivität durch Histologie und volumetrische 3D-Rekonstruktion bestimmt.
Die generierten Daten deuten darauf hin, dass die Ultraschallabgabe von Antikörpern ein potenziell attraktiver Ansatz zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ist. Das Protokoll kann in ähnlicher Weise auf andere Arzneimittelkandidaten sowie auf Modellladungen wie fluoreszierend markiertes Dextrans definierter Größen angewendet werden14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880128C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 antibody labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A20186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 antibody</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1957GA</td>
			<td>Use 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter (Multisizer 4e)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>Use 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>head holder (model SG-4N, Narishige Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Use 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>#8547008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflow flow solution</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared imaging system Odyssey Fc</td>
			<td>Licor</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octafluoropropane</td>
			<td>Arcadophta</td>
			<td>0229NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIPS (Therapy Imaging Probe System)</td>
			<td>Philips Research</td>
			<td>TIPS_007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of antibodies into the brain using focused scanning ultrasound

Nur ein kleiner Teil der therapeutischen Antikörper, die auf Hirnerkrankungen abzielen, wird vom Gehirn aufgenommen. Fokussierter Ultraschall bietet die Möglichkeit, die Aufnahme von Antikörpern und das Engagement durch vorübergehende Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu erhöhen. In unserem Labor entwickeln wir Therapieansätze für neurodegenerative Erkrankungen, bei denen ein Antikörper in verschiedenen Formaten mittels Mikrobläschen über die BHS abgegeben wird, begleitet von einer fokussierten Ultraschallanwendung durch den Schädel, der auf mehrere Stellen abzielt, ein Ansatz, den wir als Scanning-Ultraschall (SUS) bezeichnen. Die mechanische Wirkung von Mikroblasen und Ultraschall auf Blutgefäße erhöht den parazellulären Transport über die BHS, indem sie Tight Junctions vorübergehend trennt und die vesikelvermittelte Transzytose verbessert, so dass Antikörper und Therapeutika effektiv kreuzen können. Darüber hinaus erleichtert Ultraschall auch die Aufnahme von Antikörpern aus dem interstitiellen Gehirn in Gehirnzellen wie Neuronen, in denen sich der Antikörper im gesamten Zellkörper und sogar in neuritische Prozesse verteilt. In unseren Studien werden fluoreszierend markierte Antikörper hergestellt, mit intern hergestellten lipidbasierten Mikroblasen gemischt und in Mäuse injiziert, unmittelbar bevor SUS auf das Gehirn aufgetragen wird. Anschließend wird die erhöhte Antikörperkonzentration im Gehirn quantifiziert. Um Veränderungen in der normalen Homöostase des Gehirns zu berücksichtigen, kann die Mikroglia-Phagozytose als zellulärer Marker verwendet werden. Die generierten Daten deuten darauf hin, dass die Ultraschallabgabe von Antikörpern ein attraktiver Ansatz zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ist.

Mit diesem Protokoll werden fluoreszenzmarkierte Antikörper an das Gehirn abgegeben und können zusammen mit der Mikroglia-Aktivierung nachgewiesen werden. Die Schlussfolgerung, die gezogen werden kann, ist, dass die Verwendung von fokussiertem Ultraschall und Mikroblasen die Aufnahme von Antikörpern im Gehirn deutlich verbessert und Antikörper an das gesamte Gehirn oder die Hemisphäre einer Maus abgeben kann, wenn sie in einem Scanning-Modus verwendet wird. Abbildung 1 zeigt das TIPS-Ul...

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Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Hier wird ein Protokoll zur vorübergehenden Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) entweder fokal oder in einem Mausgehirn vorgestellt, um fluoreszenzmarkierte Antikörper zu liefern und Mikroglia zu aktivieren. Ebenfalls vorgestellt wird eine Methode zum Nachweis der Abgabe von Antikörpern und der Aktivierung von Mikroglia durch die Histologie.

Abgabe von Antikörpern in das Gehirn mittels fokussiertem Scanning-Ultraschall

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.0K Aufrufe.  The University of Queensland. Hier wird ein Protokoll zur vorübergehenden Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) entweder fokal oder in einem Mausgehirn vorgestellt, um fluoreszenzmarkierte Antikörper zu liefern und Mikroglia zu aktivieren. Ebenfalls vorgestellt wird eine Methode zum Nachweis der Abgabe von Antikörpern und der Aktivierung von Mikroglia durch die Histologie.

Serie: Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Ultraschall-gesteuerte Mikroinjektion in der Maus Vorderhirnneuronen In Utero In E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Forschung

Neurowissenschaften

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Maus Mikroinfusionstechnik für Zielsubstanz Lieferung in das ZNS<i&gt; über</i&gt; Die Arteria carotis interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an approach provides a safe delivery method by-passing the blood brain barrier (BBB), thus allowing treatment with therapeutics with poor BBB-permeability or those for which systemic exposure is not desired, e.g., due to toxicity. CED requires optimization of the catheter design, injection protocol, and properties of the infusate. With this protocol we describe how to perform CED of a solution containing up to 20 &#181;g of an antibody into the caudate putamen of mice. It describes preparation of step catheters, testing them in vitro and performing the CED in mice using a ramping injection program. The protocol can be readily adjusted for other infusion volumes and can be used for injecting various tracers or pharmacologically active or inactive substances, including chemotherapeutics, cytokines, viral particles, and liposomes.

Convection-enhanced delivery (CED) is a method enabling effective delivery of therapeutics into the brain by direct perfusion of large tissue volumes. The procedure requires the use of catheters and an optimized injection procedure. This protocol describes a methodology for CED of an antibody into a mouse brain.

Lieferung von Antikörpern in das Murine Gehirn über Konvektionsverstärkte Lieferung

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Ein Benchtop-Ansatz zur standortspezifischen Blut-Hirn-Barriere-Öffnung mit fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Ein hochdurchsatzgesteuertes, stereotaktisches Neuronavigations- und fokussiertes Ultraschallsystem für die Öffnung der Blut-Hirn-Barriere bei Nagetieren

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

Gezielte neuronale Verletzung für die nicht-invasive Trennung von Gehirn-Schaltung

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...