この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム、グラントXDB27040106によって支えられた。

1. サンプル準備
<ol><li>コントロールとストレス処理苗(1 g)をアルミニウム箔で収穫し、液体窒素でサンプルを凍結フラッシュします。 注:通常、成熟した植物よりも2週齢の苗からより高いタンパク質濃度が観察されます。1グラムの苗木は約10mgのタンパク質ライセートを生成し、MS分析には十分です。すべての遠心段階は、ステップ1で16,000 x g で行われます。</li>
	<li>液体窒素で満たされた乳鉢と害虫を使用して、冷凍苗を細かい粉末に粉砕します。</li>
	<li>10 mM トリス(2-カルボキセチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)、40 mM 2-クロロアセタミド(CAA)、プロテアーゼおよびインヒビターアセクターゼ阻害剤を1mL加えて、乳鉢の中で、100 mMトリス-HCl、pH 8.5)を加えて、乳鉢を混ぜます。</li>
	<li>植物のライゼートを1.5mLチューブに移し、95°Cで5分間加熱します。</li>
	<li>チューブを氷の上に10分間置きます。10 sの氷の上にチューブを超音波処理し、10 sのために一時停止し、3回繰り返します。</li>
	<li>20分間チューブを遠心分離し、植物の150 μLを1.5 mLチューブに入れ、</li>
	<li>チューブに600μLの100%メタノールを加えます。渦とチューブをスピンダウン。</li>
	<li>100%クロロホルムの150μLをチューブに加えます。渦とチューブをスピンダウン。</li>
	<li>450 μLの ddH2O をチューブに加えます。3分間のボルテックスと遠心分離管。</li>
	<li>上の水層を破棄します。チューブに600μLの100%メタノールを加えます。チューブを3分間遠心し、溶液を捨てます。</li>
	<li>600 μLのメタノールを600 μLで洗浄します。溶液を捨て、空気乾燥してプロテインペレットを乾燥させます。</li>
	<li>タンパク質ペレットを600 μLの消化バッファー(12 mM ナトリウムデオキシコール酸ナトリウム(SDC)/12 mM ラウロイルサルコシナートナトリウム(SLS)を 100 mM Tris-HCl、pH 8.5 で再懸濁します。懸濁液が均質化されるまでチューブを超音波処理します。</li>
	<li>BCAキットを使用してタンパク質濃度を測定し、消化バッファーで濃度を4 μg/μLに調整します。100 μLのライセート(400 μgタンパク質)を新しいチューブに移します。</li>
	<li>292 μLの50 mMの重炭酸トリエチラムモニウム(TEAB)と8 μLのLys-C(2.5単位/mL)をチューブに加えます。37°Cで3時間インキュベートする。</li>
	<li>チューブに8 μgのトリプシンを含む50 mM TEABの100 μLを加えます。37°Cで12時間インキュベートする。</li>
	<li>25 μLの10%トリフルオロ酢酸(TFA)をチューブに加えます。4°Cで20分間、ボルテックスと遠心分離機を使用します。</li>
	<li>上清を、脱塩用のコンディショニングデソルトカラムに移します。真空遠心濃縮器を使用して溶出液を乾燥させます。 注:メタノール1mLで樹脂を活性化し、その後に0.1%TFAの1mLを80%アセトニトリル(ACN)で活性化します。5%ACNで0.1%TFAの少なくとも3 mLの有機溶媒を洗い流してください。工程1.16で調製した酸性化ペプチドサンプルをカラムにロードし、その後、少なくとも3 mLの0.1%TFAを5%ACNで洗浄した。高塩濃度のサンプルに対して、より多くのせい剤が必要な場合があります。80% ACNで0.1%TFAの1 mLでリンペプチドをエルプ。</li>
</ol>2. タンデムマスタグ(TMT)ラベル付け
<ol><li>乾燥したペプチドを100 μLの200 mM 4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)、pH 8.5に再懸濁します。</li>
	<li>各チャネル(0.8mg)のTMT試薬を40μLの無水ACNに溶解します。5分間のTMT試薬チューブをボルテックスし、それをスピンダウンします。</li>
	<li>40 μLのTMTをサンプルチューブに移し、室温で1時間インキュベートします。 注:この実験では、チャネル126〜128をマンニトール処理なしで植物の3つの生物学的複製で標識し、チャネル129〜131はマンニトール処理を伴う植物の3つの生物学的複製で標識した。</li>
	<li>5%のヒドロキシルアミンを8μL加え、15分間インキュベートします。</li>
	<li>5 mLチューブに6サンプルを混ぜ、10%TFAの14 μLを加えます。</li>
	<li>チューブに0.1%TFAの3,876 μLを加えます。渦とスピンダウン。</li>
	<li>溶液を、脱塩用のコンディショニング脱塩カラムに移します。エマルエーターを使用して溶出物を乾燥させます。</li>
</ol>3. IMAC ステージチップの作成
<ol><li>ポリプロピレンフリットディスクを貫通するために16G鈍エンドの針を使用してください。 注: ディスクの表面に対してカッターを垂直に保持し、カッターを数回ロールして、ディスクが完全に切除されていることを確認します。保管のためにペトリ皿にディスクを置きます。針を200μLのピペットチップに入れ、プランジャーを使用してフリットを先端に押し込みます。</li>
	<li>プランジャーを使用して先端にそっとフリットを押し込み、先端の端をキャップします。<ol>
<li>同じ圧力でフリットディスクをチップに入れ、再現性を向上させます。ステージチップの再現性は、遠心分離機のタイミングと技術的な複製の再現性に影響を与える一定の背圧にとって重要です。</li>
		<li>ステージのヒントがコンディショニングステップ中に高い背圧を示す場合は、サンプルをロードする際にチップが詰まらないようにチップを捨てます。ディスクが強く押し込みすぎて位置に収められている可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni-NTAスピンカラムを反転し、1.5 mLチューブに配置します。</li>
	<li>プランジャーを使用してNi-NTAビーズのフリットを軽く押し、ビーズをチューブに押し込みます。 注:スピンカラムでビードの損失や吸着を防ぐために、フリットを軽く押してください。</li>
</ol>4. Hp-RP ステージチップの準備
<ol><li>C8 ディスクを使用して IMAC ステージチップの説明に従って、Hp-RP ステージチップを準備します。 注:ディスクに大きな力を加えないでください。すべての遠心段階はステップ4の5分のための1,000 x g で行われる。</li>
	<li>100 μL 100%メタノールに1mgのC18ビーズをサスペンドし、ビーズ溶液をチップに通します。</li>
	<li>20 μLのバッファー 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2、pH10.0) をステージチップに加え、遠心分離によりチップを通過してバッファー 8 を通過します。</li>
	<li>ステージ先端にバッファA(200 mM NH4HCO2)の20μLを加え、遠心分離によって先端を通してバッファAを通過します。 注:使用中に遠心分離機のバランスをとり、Hp-RPステージチップが完全に乾燥していないことを確認してください。</li>
</ol>5. スピンアダプターの準備
<ol><li>1.5 mLチューブの蓋の中央に穴を穿刺するために鋭い端ピンセットを使用してください。</li>
	<li>スピンアダプタの穴にIMACステージチップまたはHp-RPステージチップを挿入します。 メモ:ステージの先端がスピンアダプタの底部に近くないことを確認します。</li>
</ol>6. IMAC ステージチップを用いたリンペプチド濃縮
<ol><li>400 μLのローディングバッファー(6%酢酸(AA)、pH 3.0)を含む 10 mg の Ni-NTA ビーズをサスペンドし、すべてのビーズ溶液をチップごとにロードします。遠心分離によって先端を通して溶液を渡す。 注:すべての遠心段階のステップはステップ6.8以外のステップ6で3分の200 x g で行われます。</li>
	<li>50 mM エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の100 μLを負荷し、IMAC ステージチップからニッケルイオンを取り除き、遠心分離によって溶液を先端に通します。</li>
	<li>100 μLの負荷バッファをステージチップにロードし、遠心分離によってチップを通して溶液を渡します。</li>
	<li>50 mM FeCl3 の 100 μL を 6% AA でステージチップにロードし、遠心分離によってチップを通して溶液を通過させます。Fe3+ イオンはIMACステージチップにキレートします。</li>
	<li>100 μLの負荷バッファをロードしてステージチップを調整し、遠心分離によってチップを通して溶液を通過させます。</li>
	<li>ステップ2.7で調製したサンプルペプチドを用いた負荷バッファーの100 μLをステージ先端にロードし、遠心分離により溶液を先端に通します。 注:新しいチューブをスピンアダプタとして取り、サンプルのフロースルーを収集し、フロースルーを冷凍庫に保存して今後の解析を行います。</li>
	<li>100 μLの洗浄バッファー (4.5% AA および 25% ACN) をステージチップにロードし、遠心分離によってチップを通して溶液を通過させます。</li>
	<li>2回目の洗浄は、ローディングバッファで行います。100 μLの負荷バッファをステージチップにロードし、1000×g遠心分離機を使用してチップを通して溶液を3分間渡します。 注:洗浄バッファーをステージチップにローディングバッファで置き換え、溶出工程中のリンペプチドの損失を排除します。リンペプチド溶出前にIMACステージ先端を平衡化し、ACNの濃度が5%未満であることを確認した。</li>
	<li>IMAC ステージの先端をハサミで前面にトリムし、トリミングした IMAC ステージチップを Hp-RP チップの内側に配置します。ステージの先端の2つの層が遠心分離機のふたに触れないようにしてください。</li>
</ol>7. Hp-RP C18ステージチップを使用したリンペプチド分画
<ol><li>100 μL の溶出バッファー (200 mM リン酸アンモニウム (NH4H2PO4))をトリミングした IMAC ステージチップに加え、遠心分離によりステージチップの 2 層を通過します。 メモ:ソリューションがステージチップを通過しない場合は、スピンダウンの速度を上げます。すべての遠心段階はステップ7の5分のための1,000 x g で行われる。Hp-RP バッファはすべて 表 1にリストされています。</li>
	<li>ピンセットを使用してIMACステージチップを廃棄し、20 μLのバッファAをHp-RPステージチップに追加し、遠心分離によって先端を通してバッファを通過させます。 メモ:すべての溶出バッファが破棄する前にIMACステージチップを通過していることを確認してください。</li>
	<li>20 μLのバッファー 1 を加えて分数 1 を溶出し、遠心分離によって新しいチューブに溶出物を集めます。バッファー 2、3、4、5、6、7、および 8 でプロセスを繰り返し、各分数を新しいチューブに集めます。真空濃縮器を使用して各画分の最終的な溶出物を乾燥させます。 注: 新しい分画バッファを準備します。各画分のスピンアダプターとして8つの新しいチューブを取ります。異なるスピンアダプターで各分数の溶出を収集します。リンペプチドは塩基性条件下では安定ではないので、濃縮器により溶出液を乾燥させるか、または10%TFAで直ちに酸性化する。</li>
</ol>8. LC-MS/MS分析とデータ分析
<ol><li>0.1%のギ酸(FA)の5μLを加え、質量分析計でサンプルを分析します。</li>
	<li>各画分に対して、6~30%のバッファB(80%ACNと0.1%FA)で90分の勾配を実行します。</li>
	<li>高い衝突エネルギー解離(HCD)を用いて上位10個の標識ペプチドをフラグメント化する。データベース検索を完了してリン酸化部位を特定します。</li>
	<li>MaxQuant ソフトウェアに生のファイルをロードし、実験に名前を付け、分数と PTM を設定します。 注: MaxQuant ソフトウェアのチュートリアルは、https://www.maxquant.org/ で見つけることができます。</li>
	<li>LC-MS/MS 実行のタイプでレポーターイオン MS2 を、アイソバリックラベルとして 6plex TMT を選択します。PIF 関数によるフィルターを有効にし、最小 PIF を 0.75 に設定します。</li>
	<li>アセチル(プロテインN-用語)、酸化(M)、およびホスホ(STY)を可変修飾のパネルに選択します。固定修正としてカルバミドメチル(C)を選択します。</li>
	<li>特定のダイジェストモードを設定し、消化酵素としてトリプシン/Pを選択し、2つの切断を逃しました。</li>
	<li>PSM 偽検出率 (FDR) およびプロテイン FDR を 0.01 に設定します。変更ペプチドの最小スコアを40に設定します。</li>
	<li>ファスタファイルのパネルに シロイヌナナ・タリアナ データベースを追加し、データベース検索を実行します。</li>
	<li>検索が完了したら、ホスホ (STY) サイトの txt ファイルを Perseus ソフトウェアに読み込みます。 注:ペルセウスソフトウェアの詳細なチュートリアルは、https://www.maxquant.org/perseus/ で見つけることができます。</li>
	<li>逆リン酸化部位を除外します。ローカライズ確率 75% をカットオフとして使用して、ローカライズされていないリン酸化部位を除外します。</li>
	<li>リン酸化部位の強度を使用して統計分析を行います。</li>
</ol>

<ol>
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著者らは利益相反を宣言しない。

植物プロテオームとホスホプロテオームのダイナミックレンジと複雑さは、依然としてホスホプロテオミクス分析の深さに対する制限要因です。10,000リン酸化部位21、22を同定するLC-MS/MS分析の単回実行の能力にもかかわらず、植物全体のホスホプロテオームのカバレッジは依然として限られている。そのため、環境ストレスに対応した植物信号ネ?...

高いサリン性、低温、干ばつは浸透応力を引き起こし、これは植物の生産性1,2に影響を与える主要な環境要因である。タンパク質リン酸化は、浸透ストレス3、4、5に対する植物応答におけるシグナル知覚および伝達を媒介する最も重要な翻訳後修飾の1つである。SNF1関連プロテインキナーゼ2s(SnRK2s)は、浸透性ストレスシグナル伝達6に関与している。SnRK2ファミリーの10人のメンバーのうち9人は、浸透性ストレス7、8に応答して有意な活性化を示す。snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 10デクサプル(snrk2-dec)全10個のSnRK2に変異を有する変異体は、浸透圧ストレスに対する過敏症を示した。snrk2-dec変異体において、イノシトール1,4,5-トリスリン酸(IP3)の浸透ストレス誘導蓄積、アブシジン酸(ABA)生合成、および遺伝子発現が強く減少し、浸透応力応答におけるSnRK2sの重要な役割を強調する6。しかし、SnRK2sキナーゼがこれらの生物学的プロセスをどのように調節するのかはまだ不明である。浸透性ストレスに応答してホスホプロテオミクスの変化をプロファイリングすることは、このギャップを埋め、植物の浸透性ストレス誘発防御メカニズムを引き出す効率的な方法です。
質量分析法(MS)は植物ホスホプロテオーム9をマッピングするための強力な技術です。しかし、植物ホスホプロテオミクスの特性評価は、植物プロテオームのダイナミックレンジと植物のリセート4の複雑さのために依然として課題である。これらの課題を克服するために、光合成顔料や二次代謝産物などの望ましくない干渉を排除し、植物ホスホプロテオーム10の深い被覆を可能にする普遍的な植物ホスホプロテオミクスワークフローを開発しました。固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)や金属酸化物クロマトグラフィー(MOC)などのいくつかのリンペプチド濃縮方法は、MS分析11、12、13、14、15、16の前にリンペプチドを濃縮するために開発されています。リンペプチドと共に精製する酸性非リンペプチドは、リンペプチド検出のための主要な干渉である。以前は、非リンペプチドの結合を排除するためにIMACローディングバッファーのpH値および有機酸濃度を標準化し、前分画工程11をバイパスして90%以上の濃縮特異性を得た。
リンペプチド濃縮および分画の多段階プロセスにおけるサンプル損失は、リンペプチド同定の感度およびリンタンパク質被覆の深さを妨げる。ストップアンドゴー抽出のヒント(ステージのヒント)は、先端の端部をキャップする小さなディスクを含むピペットチップであり、ペプチド分画および洗浄17のためのクロマトグラフィーと組み込むことができる。段階の先端プロシージャの間のサンプル損失は管間のサンプルの移動を避けることによって最小にすることができる。Ga3+-IMACおよびFe3+-IMACでは、低い多量リン酸化ペプチドを単一リン酸化ペプチドから分離し、ヒトホスホプロテオーム15の深さを改善したステージチップの導入に成功しました。また、高pH逆相(Hp-RP)ステージ先端の使用は、強いカチオン交換(SCX)および強いアニオン交換(SAX)クロマトグラフィー18と比較して、ヒト膜プロテオームの広い範囲を実証している。そのため、IMAC と Hp-RP ステージチップ技術を統合することで、簡単さ、高い特異性、高スループットで植物のホスホプロテオームのカバレッジを向上させることができます。我々は、この戦略が、植物ホスホプロテオーム19の強化された深さを表す、シロイヌナズナの苗から20,000以上のリン酸化部位を同定したことを実証した。
ここでは、 シロイヌナズナ におけるホスホプロテオミクスプロファイリングのためのステージ先端ベースのホスホプロテオミクスプロトコルを報告する。このワークフローは、浸透応力に応答して野生型および snrk2-dec 変異苗のホスホプロテオミクス摂動を研究するために適用された。ホスホプロテオミクス解析では、キナーゼ活性化と初期浸透ストレスシグナル伝達に関与するリン酸化部位が明らかになった。野生型と snrk2-dec 変異型ホスホプロテオームデータの比較分析は、高植物におけるオスモアストレスシグナル伝達において重要な役割を果たすRaf様キナーゼ(RAF)-SnRK2キナーゼカスケードの発見を導いた。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipet tip</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1739311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5438080100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium phosphate monbasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-ended needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>90516</td>
			<td>Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-AQ beads</td>
			<td>Dr. Maisch</td>
			<td>ReproSil-Pur-C18-AQ 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C8 Empore disk</td>
			<td>3 M</td>
			<td>2214</td>
			<td>47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CX1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td></td>
			<td>Perseus 1.6.2.1</td>
			<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5330020050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12131024</td>
			<td>Frits for SPE Cartridges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1153334000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Velos Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano LC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Easy-nLC 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>31014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plunger</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1122-01</td>
			<td>Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 &#956;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>search engine software</td>
			<td></td>
			<td>MaxQuant 1.5.4.1</td>
			<td>https://www.maxquant.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEP-PAK Cartridge 50 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT054960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SPD121P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 6-plex</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phosphoproteomic strategy for profiling osmotic stress signaling in arabidopsis

タンパク質リン酸化は、浸透状態下での酵素活性と遺伝子発現の調節に不可欠です。質量分析法(MS)ベースのホスホプロテオミクスは、植物シグナル伝達の研究方法を変えました。しかし、カバレッジの深さを達成するための多くの出発材料と長期のMS測定時間の要件は、植物の世界的なホスホプロテオミクス変化のハイスループット研究の制限要因となっています。植物ホスホプロテオミクスの感度とスループットを向上させるために、浸透応力に応答して植物リン酸化摂動の迅速かつ包括的な分析のためのタンデムマスタグ(TMT)標識と相まって、ストップアンドゴー抽出(ステージ)チップベースのホスホプロテオミクスアプローチを開発しました。ステージチップ技術のシンプルさと高スループットを活用して、全体の手順は、リンペプチド濃縮、分画、およびサンプルクリーニングステップを完了するために2つのヒントを使用して約1時間を要し、アプローチの使いやすく、高い効率を示唆しています。このアプローチは、植物のリンプロテオミクス分析(>11,000リンペプチド同定)を提供するだけでなく、隣接する分画間の優れた分離効率(<5%のオーバーラップ)を示します。また、TMT標識を用いて多重化が行われ、野生型および snrk2 デクプル変異型植物のホスホプロテオミクス変化を定量化した。このアプローチは、陸上植物における初期の浸透シグナル伝達の理解に光を当てる浸透性ストレスに応答して、Raf様キナーゼのリン酸化事象を明らかにするためにうまく使用されている。

このワークフローの性能を実証するために、IMACステージチップとHp-RPステージチップ分画を利用して、マンニトール処理の有無にかかわらず野生型および snrk2-dec 変異苗のホスホプロテオミクス変化を30分間測定しました。各サンプルは生物学的三数で行われ、実験ワークフローは 図1に示されている。各サンプルの消化されたペプチド(400 μg)を1つのTMT-6plexチャネ...

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Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

ここに提示されるホスホプロテオミクスアプローチ、すなわち、シロイヌモゼスホスファプロテオームのハイスループットと深いカバレッジを提供するリンポプロテオミクスに基づく抽出チップを停止して行く。このアプローチは、シロイヌナズナの浸透性ストレスシグナル伝達の概要を示す。

シロイヌナズナにおける浸透性ストレスシグナル伝達のプロファイリングのためのホスホプロテオミクス戦略

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

phosphoproteomic-strategy-for-profiling-osmotic-stress-signaling

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

5.1K ビュー.  Carnegie Institute for Science. ここに提示されるホスホプロテオミクスアプローチ、すなわち、シロイヌモゼスホスファプロテオームのハイスループットと深いカバレッジを提供するリンポプロテオミクスに基づく抽出チップを停止して行く。このアプローチは、シロイヌナズナの浸透性ストレスシグナル伝達の概要を示す。

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Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

Sheathless Capillary Electrophoresis&amp;#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

生化学

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

(CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in eukaryotic cells. Precise identification of nitration sites on proteins is crucial for understanding the physiological and pathological processes related to protein nitration, such as inflammation, aging, and cancer. Since the nitrated proteins are of low abundance in cells even under induced conditions, no universal and efficient methods have been developed for the profiling and identification of protein nitration sites. Here we describe a protocol for nitropeptide enrichment by using a chemical reduction reaction and biotin labeling, followed by high resolution mass spectrometry. In our method, nitropeptide derivatives can be identified with high accuracy. Our method exhibits two advantages compared to the previously reported methods. First, dimethyl labeling is used to block the primary amine on nitropeptides, which can be used to generate quantitative results. Second, a disulfide bond containing NHS-biotin reagent is used for the enrichment, which can be further reduced and alkylated to enhance the detection signal on a mass spectrometer. This protocol has been successfully applied to the model peptide Angiotensin II in the current paper.

Proteomic profiling of tyrosine-nitrated proteins has been a challenging technique due to the low abundance of the 3-nitrotyrosine modification. Here we describe a novel approach for nitropeptide enrichment and profiling by using Angiotensin II as the model. This method can be extended for other in vitro or in vivo systems.

アンジオテンシンIIによるニトロペプチドプロファイリングと同定

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

ハイスループットプリマゼプロファイリングを用いたDNAプリマゼによるDNA配列認識

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and homeostasis of the vasculature system Therefore, deregulation in this signaling pathway results in severe vascular pathologies, such as pulmonary artery hypertension, hereditary hemorrhagic telangiectasia, and atherosclerosis. Endothelial cells (ECs), as the innermost layer of blood vessels, are constantly exposed to fluid shear stress (SS). Abnormal patterns of fluid SS have been shown to enhance TGF&#946;/BMP signaling, which, together with other stimuli, induce atherogenesis. In relation to this, atheroprone, low laminar SS was found to enhance TGF&#946;/BMP signaling while atheroprotective, high laminar SS, diminishes this signaling. To efficiently analyze the activation of these pathways, we designed a workflow to investigate the formation of transcription factor complexes under low laminar SS and high laminar SS conditions using a commercially available pneumatic pump system and proximity ligation assay (PLA).
Active TGF&#946;/BMP-signaling requires the formation of trimeric SMAD complexes consisting of two regulatory SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 and SMAD1/5/8 for TGF&#946; and BMP signaling, respectively) with a common mediator SMAD (co-SMAD; SMAD4). Using PLA targeting different subunits of the trimeric SMAD-complex, i.e., either R-SMAD/co-SMAD or R-SMAD/R-SMAD, the formation of active SMAD transcription factor complexes can be measured quantitatively and spatially using fluorescence microscopy.
The usage of flow slides with 6 small parallel channels, that can be connected in series, allows for the investigation of the transcription factor complex formation and inclusion of necessary controls. 
The workflow explained here can be easily adapted for studies targeting the proximity of SMADs to other transcription factors or to transcription factor complexes other than SMADs, in different fluid SS conditions. The workflow presented here shows a quick and effective way to study the fluid SS induced TGF&#946;/BMP signaling in ECs, both quantitatively and spatially.

Here, we establish a protocol to simultaneously visualize and analyze multiple SMAD complexes using proximity ligation assay (PLA) in endothelial cells exposed to pathological and physiological fluid shear stress conditions.

近接ライゲーションアッセイを用いた異流体せん断応力条件下でのTGFβ/BMP/SMADシグナル伝達の可視化と定量化

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

クライオ電子顕微鏡構造研究のためのストレプトアビジンアフィニティーグリッドの作製

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, including sample denaturation and preferential orientations that can occur due to the air-water interface. Streptavidin affinity grids, however, are currently utilized by few cryo-EM labs because they are not commercially available and require a careful fabrication process. Two-dimensional streptavidin crystals are grown onto a biotinylated lipid monolayer that is applied directly to standard holey-carbon cryo-EM grids. The high-affinity interaction between streptavidin and biotin allows for the subsequent binding of biotinylated samples that are protected from the air-water interface during cryo-EM sample preparation. Additionally, these grids provide a strategy for concentrating samples available in limited quantities and purifying protein complexes of interest directly on the grids. Here, a step-by-step, optimized protocol is provided for the robust fabrication of streptavidin affinity grids for use in cryo-EM and negative-stain experiments. Additionally, a trouble-shooting guide is included for commonly experienced challenges to make the use of streptavidin affinity grids more accessible to the larger cryo-EM community.

著者スポットライト:ストレプトアビジン-ビオチンアプローチによるクライオ電子顕微鏡サンプル調製の強化

A step-by-step protocol for fabricating streptavidin affinity grids is provided for use in structural studies of challenging macromolecular samples by cryo-electron microscopy.

クライオ電子顕微鏡サンプル調製のためのストレプトアビジン-アフィニティーグリッド作製

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...