이 작품은 중국 과학 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램, 그랜트 XDB27040106에 의해 지원되었다.

1. 샘플 준비
<ol><li>알루미늄 호일에 대조군 및 응력 처리 모종(1g)을 수확하고 액체 질소로 샘플을 동결시한다. 참고: 단백질 농도가 높은 것은 일반적으로 성숙한 식물에서 보다 2 주 오래 된 모종에서 관찰. 모종의 한 그램은 MS 분석에 충분 한 단백질 lysate의 약 10 mg을 생성 합니다. 모든 원심 분리 단계는 1단계에서 16,000 x g에서 수행됩니다.</li>
	<li>냉동 모종을 박격포와 액체 질소로 채워진 유봉을 사용하여 미세 한 분말로 갈아 냅니다.</li>
	<li>용해 버퍼 1mL 추가(100mM Tris-HCl에서 6M 구니딘-HCl, pH 8.5) 10mM Tris (2-carboxyethyl)인 포스핀 염산염(TCEP), 40mMM 2 클로로아세타미드(CAA), 프로테아제 억제제 및 인산 억제제 칵테일을 박격포에 넣고 유봉의 도움으로 혼합한다.</li>
	<li>식물용 용액을 1.5mL 튜브로 옮기고 95°C에서 5분 동안 가열합니다.</li>
	<li>튜브를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 얼음 에 튜브를 10 초 동안 초음파 처리하고 10 초 동안 일시 중지하고 세 번 반복합니다.</li>
	<li>원심 분리는 20 분 동안 튜브를 원심 분리하고 식물의 150 μL을 1.5 mL 튜브로 lysate.</li>
	<li>튜브에 100% 메탄올의 600 μL을 추가합니다. 소용돌이와 튜브 아래로 회전.</li>
	<li>튜브에 100% 클로로폼의 150 μL을 추가합니다. 소용돌이와 튜브 아래로 회전.</li>
	<li>튜브에 ddH2O의 450 μL을 추가합니다. 소용돌이와 원심분리기는 3분 동안 튜브를 분리합니다.</li>
	<li>상부 수성 층을 폐기합니다. 튜브에 100% 메탄올의 600 μL을 추가합니다. 튜브를 3분 동안 원심분리한 다음 용액을 폐기합니다.</li>
	<li>단백질 펠릿을 100% 메탄올의 600 μL로 세척합니다. 용액을 버리고 단백질 펠릿을 공기 건조시십시오.</li>
	<li>단백질 펠릿을 소화 완충제 600μL로 재차 스펜싱(12mM 나트륨 탈옥초레이트(SDC)/12m 나트륨 라우로일 사르코시나테(SLS)에서 100mM Tris-HCl, pH 8.5)로 재차한다. 서스펜션이 균질화 될 때까지 튜브를 초음파 처리합니다.</li>
	<li>BCA 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하고 소화 완충액으로 농도를 4 μg/μL로 조정합니다. 용사(400 μg 단백질)의 100 μL을 새로운 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>50m 트리에틸람모늄 중탄산염(TEAB)의 292 μL과 리스-C(2.5단위/mL)의 8μL을 튜브에 추가합니다. 37°C에서 튜브를 3시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>튜브에 8 μg 트립신과 함께 50 mM TEAB의 100 μL을 추가합니다. 튜브를 37°C에서 12시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>튜브에 10% 트리플루오로아세산(TFA)의 25μL을 추가합니다. 4°C에서 20분 동안 튜브를 소용돌이 및 원심분리합니다.</li>
	<li>상신을 탈염을 위해 조건부 탈염 열로 옮김합니다. 진공 원심분리기 농축기를 사용하여 용황을 건조시하십시오. 참고: 메탄올 1mL로 수지 활성화, 80% 아세토닐(ACN)에서 0.1% TFA의 1mL이 뒤를 이었다. 5% ACN에서 0.1% TFA의 3mL 이상으로 유기 용매를 씻어내시다. 1.16단계에서 제조된 산성 펩티드 샘플을 적재한 다음 5% ACN에서 0.1% TFA의 3mL 이상으로 컬럼을 세척한다. 염농도가 높은 시료에 더 많은 세체가 필요할 수 있습니다. 80% ACN에서 0.1% TFA의 1mL로 인포스펩티드를 엘테.</li>
</ol>2. 탠덤 매스 태그(TMT) 라벨링
<ol><li>말린 펩티드를 200mM 4-(2-하이드록스테틸)-1-파이프라진에탄술포닉산(HEPES), pH 8.5의 100 μL로 재차질한다.</li>
	<li>각 채널(0.8 mg)의 TMT 시약을 무수액 ACN의 40 μL에서 용해하십시오. TMT 시약 튜브를 5분 동안 소용돌이쳐 아래로 회전시십시오.</li>
	<li>TMT의 40 μL을 샘플 튜브로 옮기고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 참고: 이 실험에서 채널 126 에서 128은 매니톨 처리없이 식물의 3 개의 생물학적 복제로 표지되었으며 채널 129 에서 131은 매니톨 치료를 가진 식물의 세 가지 생물학적 복제로 표지되었습니다.</li>
	<li>5% 하이드록실라민8μL을 넣고 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>5mL 튜브에 6개의 샘플을 섞고 10% TFA의 14 μL을 추가합니다.</li>
	<li>튜브에 0.1% TFA의 3,876 μL을 추가합니다. 소용돌이와 스핀 다운.</li>
	<li>솔루션을 탈염을 위해 조건부 탈염 열로 전송합니다. 증발기로 용루를 건조시다.</li>
</ol>3. IMAC 스테이지 팁 준비
<ol><li>폴리 프로필렌 프릿 디스크를 관통하는 16 G 무딘 엔드 바늘을 사용합니다. 참고: 커터를 디스크 표면에 수직으로 잡고 커터를 몇 번 굴려 디스크가 완전히 절제되었는지 확인합니다. 디스크를 페트리 접시에 담아 보관합니다. 바늘을 200 μL 파이펫 팁에 넣고 플런저를 사용하여 프릿을 팁에 밀어 넣습니다.</li>
	<li>플런저를 사용하여 프릿을 팁 끝으로 부드럽게 눌러 팁 끝을 캡합니다.<ol>
<li>더 나은 재현성을 제공하는 동일한 압력으로 팁에 frit 디스크를 배치합니다. 스테이지 팁 생산의 재현성은 원심분리기 단계의 타이밍과 기술 복제 사이의 재현성에 영향을 미치는 일정한 백압에 중요합니다.</li>
		<li>스테이지 팁이 컨디셔닝 단계에서 높은 역압을 표시하는 경우 샘플을 로드할 때 팁이 막히는 것을 방지하십시오. 디스크가 너무 단단히 제자리에 끼였을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni-NTA 스핀 컬럼을 반전시키고 1.5mL 튜브에 배치하십시오.</li>
	<li>플런저를 사용하여 Ni-NTA 구슬의 프릿을 부드럽게 누르고 구슬을 튜브에 밀어 넣습니다. 참고: 스핀 컬럼의 잠재적인 비드 손실 이나 흡착을 피하기 위해 프리를 부드럽게 밀어야 합니다.</li>
</ol>4. Hp-RP 단계 팁 준비
<ol><li>C8 디스크를 사용하여 IMAC 단계 팁에 설명된 대로 Hp-RP 단계 팁을 준비합니다. 참고: 조밀하게 포장된 frit을 초래하고 스테이지 팁의 역압이 증가할 수 있으므로 디스크에 큰 힘을 적용하지 마십시오. 모든 원심 분리 단계는 4단계에서 5분 동안 1,000 x g에서 수행됩니다.</li>
	<li>100 μL 100% 메탄올에 C18 구슬 1 mg을 일시 중단하고 팁을 통해 구슬 용액을 전달합니다.</li>
	<li>완충 8(80% ACN/20% 200mM NH4HCO2,pH 10.0)의 20 μL을 스테이지 팁에 추가하고 원심분리로 끝을 통해 버퍼 8을 통과한다.</li>
	<li>스테이지 팁에 버퍼 A(200mM NH4HCO2)의20 μL을 추가하고 원심분리로 끝을 통해 버퍼 A를 전달합니다. 참고: 사용 중 원심분리기의 균형을 맞추고 Hp-RP 단계 팁이 완전히 건조되지 않도록 합니다.</li>
</ol>5. 스핀 어댑터 준비
<ol><li>날카로운 엔드 핀셋을 사용하여 1.5mL 튜브의 뚜껑 중앙에 구멍을 뚫습니다.</li>
	<li>IMAC 스테이지 팁 또는 Hp-RP 단계 팁을 스핀 어댑터 구멍에 삽입합니다. 참고: 스테이지 팁이 스핀 어댑터 의 맨 아래에 가깝지 않은지 확인합니다.</li>
</ol>6. IMAC 단계 팁을 사용하여 인포펩티드 농축
<ol><li>10 mgNi-NTA 구슬을 400 μL로 적재 버퍼(6% 아세트산(AA), pH 3.0)로 중단하고 모든 구슬 용액을 팁당 로드합니다. 원심분리로 솔루션을 팁을 전달합니다. 참고: 모든 원심분리 단계는 6.8단계 외에 6단계에서 3분 동안 200 x g로 진행됩니다.</li>
	<li>IMAC 단계 팁에서 니켈 이온을 제거하고 원심분리에 의해 팁을 통과하기 위해 50m m 에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)의 100 μL을 적재한다.</li>
	<li>100 μL의 적재 버퍼를 단계 끝에 로드하고 원심분리로 솔루션을 통과합니다.</li>
	<li>스테이지 팁에 6% AA에 50mM FeCl3의 100 μL을 로드하고 원심분리로 팁을 통과합니다. Fe3+ 이온은 IMAC 스테이지 팁으로 킬레이트됩니다.</li>
	<li>100 μL의 적재 버퍼를 적재하여 스테이지 팁을 조건화하고 원심분리로 팁을 통해 용액을 전달합니다.</li>
	<li>단계 팁에 2.7 단계에서 준비된 시료 펩타이드와 하중 버퍼의 100 μL을 적재하고 원심분리에 의해 끝을 통해 용액을 전달한다. 참고: 새로운 튜브를 스핀 어댑터로 사용하여 시료의 흐름을 수집하고 향후 분석을 위해 동결기에서 유동을 저장합니다.</li>
	<li>세척 버퍼 100 μL(4.5% AA 및 25% ACN)을 스테이지 팁에 적재하고 원심분리로 팁을 통과합니다.</li>
	<li>로딩 버퍼로 두 번째 세척을 수행합니다. 100 μL의 적재 버퍼를 스테이지 팁에 적재하고 1000 × g 원심분리기를 사용하여 3분 동안 솔루션을 팁을 통과합니다. 참고: 세척 버퍼가 스테이지 팁의 적재 버퍼로 대체되어 용출 단계 중 인포펩티드의 손실을 제거합니다. ACN의 농도가 5% 미만인지 확인하기 위해 인포펩티드 용출 전에 IMAC 단계 팁을 평형화합니다.</li>
	<li>앞면의 IMAC 스테이지 팁을 가위로 트리밍하고 다듬어진 IMAC 스테이지 팁을 Hp-RP 팁 에 배치합니다. 스테이지 팁의 두 레이어가 원심분리기의 뚜껑을 건드리지 않도록 합니다.</li>
</ol>7. Hp-RP C18 단계 팁을 사용하여 인포펩티드 분획
<ol><li>용출 버퍼 100 μL(200mM 암모늄 인산염(NH4H2PO4)을트리밍된 IMAC 단계 팁에 추가하고 원심분리에 의해 단계 팁의 두 층을 통해 용액을 전달한다. 참고: 솔루션이 스테이지 팁을 통과하지 못하면 스핀 다운 속도를 높입니다. 모든 원심 분리 단계는 7단계에서 5분 동안 1,000 x g에서 수행됩니다. 모든 Hp-RP 버퍼는 표 1에나열됩니다.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 IMAC 스테이지 팁을 폐기하고 20 μL의 버퍼 A를 Hp-RP 단계 팁에 추가하고 원심분리로 버퍼를 통과합니다. 참고: 모든 용출 버퍼가 IMAC 단계 팁을 통과한 후 폐기해야 합니다.</li>
	<li>버퍼 1의 20 μL을 추가하여 분수 1을 elute하고 원심분리로 새 튜브에서 용출을 수집합니다. 버퍼 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 프로세스를 반복하여 새 튜브에서 각 분수를 수집합니다. 진공 농축기로 각 분획의 최종 용출을 건조시다. 참고: 신선한 분수 버퍼를 준비합니다. 각 분수의 스핀 어댑터로 8개의 새로운 튜브를 가져 가라. 다른 스핀 어댑터에서 각 분획의 용출을 수집합니다. 인포펩타이드는 기본적인 조건하에서 안정되지 않으므로 농축기또는 산성으로 용액을 즉시 10% TFA로 건조시하십시오.</li>
</ol>8. LC-MS/MS 분석 및 데이터 분석
<ol><li>0.1%의 μL을 추가하여 0.1%의 포믹산(FA)을 추가하고 질량 분광계로 샘플을 분석합니다.</li>
	<li>각 분수에 대해 6-30% 버퍼 B(80% ACN 및 0.1% FA)로 90분 그라데이션을 실행합니다.</li>
	<li>높은 충돌 에너지 해리(HCD)를 사용하여 상위 10개의 표지된 펩타이드를 단편화한다. 데이터베이스 검색을 완료하여 인산화 사이트를 식별합니다.</li>
	<li>원시 파일을 MaxQuant 소프트웨어에 로드하고, 실험이름을 지정하고, 분수 및 PTM을 설정합니다. 참고 : MaxQuant 소프트웨어의 튜토리얼은 https://www.maxquant.org/ 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>LC-MS/MS 실행 유형의 리포터 이온 MS2와 6plex TMT를 등불 라벨로 선택합니다. PIF 함수별로 필터를 활성화하고 최소 PIF를 0.75로 설정합니다.</li>
	<li>가변 변형 패널에 아세틸(단백질 N-term), 산화(M), 인(STY)을 선택한다. 카르바미도메틸(C)을 고정 수정으로 선택합니다.</li>
	<li>소화 모드를 특정로 설정하고, 트립신/P를 소화 효소로 선택하고, 두 개의 골짜기를 놓친다.</li>
	<li>PSM 거짓 발견율(FDR) 및 단백질 FDR을 0.01로 설정합니다. 수정된 펩티드에 대한 최소 점수를 40으로 설정합니다.</li>
	<li>fasta 파일 패널에 아라비도시스 탈리아나 데이터베이스를 추가하고 데이터베이스 검색을 실행합니다.</li>
	<li>검색이 완료되면 인(STY) 사이트의 txt 파일을 Perseus 소프트웨어에 로드합니다. 참고 : Perseus 소프트웨어의 자세한 튜토리얼은 https://www.maxquant.org/perseus/ 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>역형 인산화 부위를 걸로 합니다. 현지화 확률 75%를 컷오프로 사용하여 비지역화된 인산화 부위를 필터링합니다.</li>
	<li>통계 분석을 위해 인산화 부위의 강도를 사용합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cellular+and+molecular+responses+to+high+salinity.">Plant cellular and molecular responses to high salinity.</a> Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).</li><li>Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+tolerance+in+plants:+Changes+at+the+protein+level.">Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level.</a> Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).</li><li>Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+networks+in+the+abscisic+acid+signaling+pathway.">Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway.</a> Enzymes. 35, 27-56 (2014).</li><li>Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+challenges+in+plant+phosphoproteomics.">Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+proteome-wide+targets+of+protein+kinases+in+plant+stress+responses.">Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).</li><li>Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+decuple+mutant+reveals+the+importance+of+SnRK2+kinases+in+osmotic+stress+responses+in+vivo.">Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phosphoproteomics+identifies+SnRK2+protein+kinase+substrates+and+reveals+the+effectors+of+abscisic+acid+action.">Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).</li><li>Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+nine+sucrose+nonfermenting+1-related+protein+kinases+2+activated+by+hyperosmotic+and+saline+stresses+in+Arabidopsis+thaliana.">Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).</li><li>Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+technologies+and+applications+in+plant+biology+research.">Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).</li><li>Hsu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+plant+phosphoproteomics+workflow+and+its+application+to+Tomato+signaling+in+response+to+cold+stress.">Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).</li><li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+affinity+chromatography+revisited:+pH/acid+control+toward+high+selectivity+in+phosphoproteomics.">Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).</li><li>Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns.">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li><li>Ruprecht, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+and+reproducible+phosphopeptide+enrichment+using+iron+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+(Fe-IMAC)+columns.">Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).</li><li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+enrichment+by+aliphatic+hydroxy+acid-modified+metal+oxide+chromatography+for+nano-LC-MS/MS+in+proteomics+applications.">Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).</li><li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+phosphoproteomic+enrichment+through+complementary+metal-directed+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+identification+of+phosphopeptides+from+putative+basophilic+kinase+substrates+using+Ti+(IV)+based+IMAC+enrichment.">Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 10 (10), (2011).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+high-pH+reverse+phase+stageTip+for+sensitive+small-scale+membrane+proteomic+profiling.">Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling.</a> Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+regulation+of+the+TOR+Kinase+and+ABA+receptor+balances+plant+growth+and+stress+response.">Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response.</a> Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RAF-SnRK2+kinase+cascade+mediates+early+osmotic+stress+signaling+in+higher+plants.">A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants.</a> Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).</li><li>Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phosphoproteomics+reveals+in+vivo+insulin+signaling+dynamics.">High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).</li><li>Bekker-Jensen, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+shotgun+strategy+for+the+rapid+generation+of+comprehensive+human+proteomes.">An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes.</a> Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).</li><li>Possemato, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+phosphoproteomic+profiling+using+titanium+dioxide+and+immunoaffinity+enrichments+reveals+complementary+phosphorylation+events.">Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events.</a> Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).</li><li>Hogrebe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+common+quantification+strategies+for+large-scale+phosphoproteomics.">Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics.</a> Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+of+Arabidopsis+Highly+ABA-Induced1+identifies+AT-Hook-Like10+phosphorylation+required+for+stress+growth+regulation.">Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).</li><li>Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=through+signaling+between+wheat+and+the+fungal+pathogen+Septoria+tritici+revealed+by+proteomics+and+phosphoproteomics.">through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).</li><li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+Mass+Tag+labeling+facilitates+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+hydrophilic+phosphopeptides.">Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).</li></ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

식물 프로테오메와 인포프로테오움의 동적 범위와 복잡성은 여전히 인포프로테오믹스 분석의 깊이에 대한 제한 요소입니다. 10,000개의 인산화부위(21,22)를식별하는 단일 실행 LC-MS/MS 분석의 능력에도 불구하고, 전체 식물 인포프로테오메의 커버리지는 여전히 제한적이다. 따라서 환경 스트레스에 대응하여 식물 신호 네트워크의 글로벌 뷰를 프로파일?...

염도가 높고, 저온, 가뭄으로 인해 삼투압이 발생하며, 이는 식물 생산성1,2에영향을 미치는 주요 환경 요인이다. 단백질 인산화는 삼투압3,4,5에대한 식물 반응에서 신호 지각 및 트랜스포팅을 중재하는 가장 중요한 번역 후 변형 중 하나입니다. SNF1 관련 단백질 키나아제 2s(SnRK2s)는 삼투성 응력 신호6에관여한다. SnRK2 가족 구성원 10명 중 9명은 삼투압7,8에대한 대응으로 상당한 활성화를 보여준다. snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-12)모든 10 SnRK2에서 돌연변이를 갖는 돌연변이는 삼투압에 과민반응을 표시하였다. snrk2-dec 돌연변이체에서는, 삼투성 스트레스-유도된 이노시톨 1,4,5-트리스포산염(IP3),abscisic acid (ABA) 생합성 및 유전자 발현의 축적이 강하게 감소되어 삼투스트레스 반응6에서SnRK2s의 중요한 역할을 강조한다. 그러나, SnRK2s 키나아제는 어떻게 이 생물학 프로세스를 통제하는지 아직도 불분명합니다. 삼투압 응력에 대한 반응으로 인포프로테오믹 변화를 프로파일링하는 것은 이 격차를 해소하고 식물의 삼투압 유발 방어 메커니즘을 묘사하는 효율적인 방법입니다.
질량 분광법(MS)은 식물 인포프로테오메9를매핑하는 강력한 기술이다. 식물 인포프로테오믹스의 특성화는 식물 프로테오메의 동적 범위와 식물 리자테4의복잡성으로 인해 여전히 과제로 남아 있다. 이러한 과제를 극복하기 위해 광합성 안료 및 이차 대사 산물과 같은 원치 않는 간섭을 제거하고 식물 인포프로테오메10의깊은 커버리지를 가능하게 하는 범용 식물 인포프로테오믹 워크플로우를 개발했습니다. 고정금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 및 금속 산화물 크로마토그래피(MOC)와 같은 여러 인포펩타이드 농축 방법은 MS 분석11,12,13,14,15,16이전에인포펩티드를 농축하기 위해 개발되었다. 인스포펩티드와 함께 정화하는 산성 비인펩타이드는 인포펩티드 검출을 위한 주요 간섭이다. 이전에는 IMAC 로딩 버퍼의 pH 값 및 유기산 농도를 표준화하여 비인펩티드의 결합을 제거하고, 사전 분획단계(11)를우회하여 90% 이상의 농축 특이성을 얻었다.
인포펩티드 농축 및 분획의 다단계 공정에서 시료 손실은 인포펩티드 식별의 감도 및 인포프로테오믹 커버리지의 깊이를 저해한다. 스톱 앤 고-이동-추출 팁(무대 팁)은 팁의 끝을 캡하는 작은 디스크가 포함된 파이펫 팁으로, 펩티드 분획 및 청소17을위한 크로마토그래피와 통합할 수 있다. 단계 팁 절차 중 샘플 손실을 최소화할 수 있는 경우 튜브 간의 샘플 전달을 방지하여 최소화할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 인간 인포 프로테오메(15)의깊이를 향상 노래 인광 펩타이드에서 낮은 풍부한 다중 인광 펩티드를 분리하기 위해 Ga3 +- IMAC 및 Fe3 +-IMAC에서 단계 팁을 구현했다. 또한, 높은 pH 반전상(Hp-RP) 단계 팁의 사용은 강한 양이온 교환(SCX) 및 강력한 음이온 교환(SAX)크로마토그래피(18)에비해 인간 막 프로테오메의 폭넓은 커버리지를 입증하였다. 따라서 IMAC 및 Hp-RP 단계 팁 기술을 통합하면 단순성, 높은 특이성 및 높은 처리량으로 식물 인포프로테온 커버리지를 증가시킬 수 있습니다. 우리는 이 전략이 아라비도시스 모종에서 20,000개 이상의 인산화 부위를 확인했으며, 이는 식물 인포프로테오메19의향상된 깊이를 나타내는 것으로 입증되었다.
여기에서, 우리는 애기독증에 있는 인포프로테오믹 프로파일링을 위한 단계 팁 기지를 둔 인포프로테오믹 프로토콜을 보고합니다. 이 워크플로우는 삼투압에 대응하여 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 묘목의 인포프로테오믹 분동을 연구하기 위해 적용되었다. 인포프로테오믹 분석은 키나아제 활성화 및 초기 삼투압 신호에 연루된 인산화 부위를 밝혀냈습니다. 야생 형 및 snrk2-dec 돌연변이 인산염 데이터의 비교 분석은 높은 식물에서 osmore 응력 신호에 중요한 역할을 하는 Raf 와 같은 키나아제 (RAF)-SnRK2 키나아제 캐스케이드의 발견을 이끌어 주었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipet tip</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1739311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5438080100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium phosphate monbasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-ended needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>90516</td>
			<td>Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-AQ beads</td>
			<td>Dr. Maisch</td>
			<td>ReproSil-Pur-C18-AQ 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C8 Empore disk</td>
			<td>3 M</td>
			<td>2214</td>
			<td>47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CX1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td></td>
			<td>Perseus 1.6.2.1</td>
			<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5330020050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12131024</td>
			<td>Frits for SPE Cartridges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1153334000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Velos Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano LC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Easy-nLC 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>31014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plunger</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1122-01</td>
			<td>Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 &#956;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>search engine software</td>
			<td></td>
			<td>MaxQuant 1.5.4.1</td>
			<td>https://www.maxquant.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEP-PAK Cartridge 50 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT054960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SPD121P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 6-plex</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phosphoproteomic strategy for profiling osmotic stress signaling in arabidopsis

단백질 인산화는 삼투성 조건 하에서 효소 활성 및 유전자 발현의 조절에 매우 중요합니다. 질량 분광법 (MS)기반 인포 프로 테오믹스는 식물 신호 변환을 연구하는 방법을 변화시켰습니다. 그러나, 커버리지의 깊이를 달성하기 위해 많은 시작 재료와 장기간 MS 측정 시간의 요구 사항은 식물의 글로벌 인포 프로테오믹 변화에 대한 높은 처리량 연구에 대한 제한 요인이되고있다. 식물 인산염의 감도와 처리량을 개선하기 위해, 우리는 삼투압 스트레스에 대응하여 식물 인산화 의 신속하고 포괄적 인 분석을 위한 탠덤 질량 태그 (TMT) 라벨과 결합된 정지 및 이동 추출 (stage) 팁 기반 인포프로테오믹스 접근법을 개발했습니다. 단계 팁 기술의 단순성과 높은 처리량을 활용하여 전체 절차는 두 가지 팁을 사용하여 인포펩티드 농축, 분수 및 시료 세척 단계를 완료하는 데 약 1시간이 걸리며, 이는 접근 방식의 사용하기 쉽고 높은 효율을 시사합니다. 이 접근법은 심층적인 식물 인포프로테오믹스 분석(> 11,000인스포펩티드 식별)을 제공할 뿐만 아니라 인접한 분수 간의 우수한 분리 효율(&5% 중복)을 보여줍니다. 또한, 멀티플렉싱은 TMT 라벨링을 사용하여 야생형 및 snrk2 탈취 돌연변이 식물의 인포프로테오믹 변화를 정량화하고 있다. 이 접근법은 육상 식물의 초기 삼투압 신호에 대한 이해를 밝히는 삼투압 스트레스에 대한 응답으로 Raf와 같은 키나아제의 인광 이벤트를 성공적으로 밝히는 데 사용되었습니다.

이 워크플로우의 성능을 입증하기 위해 Hp-RP 단계 팁 분획과 결합된 IMAC 단계 팁을 활용하여 30분 동안 매니톨 처리 유무에 관계없이 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 묘목의 인포프로테오믹 변화를 측정했습니다. 각 샘플은 생물학적 삼중방식으로 수행되었으며 실험 워크플로우가 도 1로표현된다. 각 시료의 소화된 펩티드(400 μg)는 1개의 TMT-6plex 채널로 분류되었고, 풀과 ?...

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Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

여기에 제시된 인포프로테오믹 접근법, 즉 아라비도시스 인포프로테오움의 높은 처리량과 깊은 커버리지를 제공하는 추출 팁 기반인 인포프로테오믹을 이동합니다. 이 접근은 아라비도시스에서 삼투압 신호의 개요를 설명합니다.

애기독증에서 삼투압 신호 프로파일링을 위한 인포프로테오믹 전략

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

phosphoproteomic-strategy-for-profiling-osmotic-stress-signaling

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

5.1K 조회수.  Carnegie Institute for Science. 여기에 제시된 인포프로테오믹 접근법, 즉 아라비도시스 인포프로테오움의 높은 처리량과 깊은 커버리지를 제공하는 추출 팁 기반인 인포프로테오믹을 이동합니다. 이 접근은 아라비도시스에서 삼투압 신호의 개요를 설명합니다.

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Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

Sheathless Capillary Electrophoresis&amp;#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

연구

생화학

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in eukaryotic cells. Precise identification of nitration sites on proteins is crucial for understanding the physiological and pathological processes related to protein nitration, such as inflammation, aging, and cancer. Since the nitrated proteins are of low abundance in cells even under induced conditions, no universal and efficient methods have been developed for the profiling and identification of protein nitration sites. Here we describe a protocol for nitropeptide enrichment by using a chemical reduction reaction and biotin labeling, followed by high resolution mass spectrometry. In our method, nitropeptide derivatives can be identified with high accuracy. Our method exhibits two advantages compared to the previously reported methods. First, dimethyl labeling is used to block the primary amine on nitropeptides, which can be used to generate quantitative results. Second, a disulfide bond containing NHS-biotin reagent is used for the enrichment, which can be further reduced and alkylated to enhance the detection signal on a mass spectrometer. This protocol has been successfully applied to the model peptide Angiotensin II in the current paper.

Proteomic profiling of tyrosine-nitrated proteins has been a challenging technique due to the low abundance of the 3-nitrotyrosine modification. Here we describe a novel approach for nitropeptide enrichment and profiling by using Angiotensin II as the model. This method can be extended for other in vitro or in vivo systems.

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and homeostasis of the vasculature system Therefore, deregulation in this signaling pathway results in severe vascular pathologies, such as pulmonary artery hypertension, hereditary hemorrhagic telangiectasia, and atherosclerosis. Endothelial cells (ECs), as the innermost layer of blood vessels, are constantly exposed to fluid shear stress (SS). Abnormal patterns of fluid SS have been shown to enhance TGF&#946;/BMP signaling, which, together with other stimuli, induce atherogenesis. In relation to this, atheroprone, low laminar SS was found to enhance TGF&#946;/BMP signaling while atheroprotective, high laminar SS, diminishes this signaling. To efficiently analyze the activation of these pathways, we designed a workflow to investigate the formation of transcription factor complexes under low laminar SS and high laminar SS conditions using a commercially available pneumatic pump system and proximity ligation assay (PLA).
Active TGF&#946;/BMP-signaling requires the formation of trimeric SMAD complexes consisting of two regulatory SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 and SMAD1/5/8 for TGF&#946; and BMP signaling, respectively) with a common mediator SMAD (co-SMAD; SMAD4). Using PLA targeting different subunits of the trimeric SMAD-complex, i.e., either R-SMAD/co-SMAD or R-SMAD/R-SMAD, the formation of active SMAD transcription factor complexes can be measured quantitatively and spatially using fluorescence microscopy.
The usage of flow slides with 6 small parallel channels, that can be connected in series, allows for the investigation of the transcription factor complex formation and inclusion of necessary controls. 
The workflow explained here can be easily adapted for studies targeting the proximity of SMADs to other transcription factors or to transcription factor complexes other than SMADs, in different fluid SS conditions. The workflow presented here shows a quick and effective way to study the fluid SS induced TGF&#946;/BMP signaling in ECs, both quantitatively and spatially.

Here, we establish a protocol to simultaneously visualize and analyze multiple SMAD complexes using proximity ligation assay (PLA) in endothelial cells exposed to pathological and physiological fluid shear stress conditions.

근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Cryo-EM 구조 연구를 위한 Streptavidin 친화성 그리드 제작

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, including sample denaturation and preferential orientations that can occur due to the air-water interface. Streptavidin affinity grids, however, are currently utilized by few cryo-EM labs because they are not commercially available and require a careful fabrication process. Two-dimensional streptavidin crystals are grown onto a biotinylated lipid monolayer that is applied directly to standard holey-carbon cryo-EM grids. The high-affinity interaction between streptavidin and biotin allows for the subsequent binding of biotinylated samples that are protected from the air-water interface during cryo-EM sample preparation. Additionally, these grids provide a strategy for concentrating samples available in limited quantities and purifying protein complexes of interest directly on the grids. Here, a step-by-step, optimized protocol is provided for the robust fabrication of streptavidin affinity grids for use in cryo-EM and negative-stain experiments. Additionally, a trouble-shooting guide is included for commonly experienced challenges to make the use of streptavidin affinity grids more accessible to the larger cryo-EM community.

저자 스포트라이트: Streptavidin-Biotin 접근법을 통한 Cryo-EM 시료 전처리 향상

A step-by-step protocol for fabricating streptavidin affinity grids is provided for use in structural studies of challenging macromolecular samples by cryo-electron microscopy.

극저온 전자 현미경 시료 전처리를 위한 Streptavidin-Affinity Grid 제작

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...