Name: biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions
Uploaded: 2015-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
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The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

ポリマービーズへのタンパク質の1。化学カップリング<ol><li>チオールアミン方向性結合 注意：このプロトコルは、タンパク質が、スルホスクシンイミジル4-（p個の -maleimidophenyl）ブチレート架橋剤として（スルホSMPB）（ 図1）を使用して 、ポリマービーズを官能アミンを含有するシステインの結合に適しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> 図1の架橋ポリマービーズへのタンパク質の方向性チオール-アミンカップリングのために使用される戦略を。アミン変性ポリスチレンビーズは、スルホSMPBで活性化されています。マレイミドは、ビーズに方向性結合タンパク質に遊離システインと反応する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol><li>試薬の調製： <ol><li> PBS（100 mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH7.0）で、オートクレーブを準備します。 </lI&gt; <li>使用直前に100倍の株式TCEP（トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン）の（PBS中0.5 Mまたは287 mg / mlの）を準備します。 </li><li>使用直前に5倍の株式（10 mm以上の dH 2 O中4.58 mg / mlの）スルホSMPBのを準備します。 </li><li>使用直前にシステイン（PBS、pHを7.0 mlの500 mMのか、88ミリグラム/）10倍の在庫を準備します。 </li></ol></li><li>ビーズの活性化： <ol><li>静かに反転させてビーズ懸濁液を混合し、1ミリリットル滅菌PBS、pHが7.0を含む滅菌1.5mlチューブにビーズ懸濁液（例えば、12ミリリットル）の必要量を転送します。 </li><li>静かに微量（16,000×gで2分間）で遠心分離することにより、ビーズ、ペレットを洗浄するために上下にピペットと。 </li><li>慎重にピペットで上清を除去し、廃棄します。新鮮な滅菌PBS 1mlにビーズペレットを再懸濁し、洗浄工程を繰り返します。 PBS 0.8 ml中にビーズペレットを再懸濁。 </li><li> 、新たに調製した10mMのスルホSMPBの200ミリリットルを追加し、最終的なコンセントを与えること2 mMのの比。 </li><li>回転ホイール上で25℃で1時間のためのビーズ懸濁液をインキュベートします。 </li></ol></li><li>タンパク質の削減： <ol><li>それはすぐに活性化したビーズに添加することができるように、活性化工程のインキュベーション期間中、次のカップリング工程のためのタンパク質を調製します。 注：この還元工程は、常に、GST（グルタチオンSトランスフェラーゼ）融合タンパク質のために必要とされていないが、それは高い結合効率を確保することをお勧めします。 <ol><li>タンパク質濃度を確認し、カップリング反応に必要な最終濃度に調整。注：PBSで6 mMのタンパク質、および1 mlの容量は、通常使用されています。 </li><li> 5 mMのの最終濃度を得TCEPの株式を追加します。 RTで30分間溶液をインキュベートします。 注：反応混合物を直接、次のカップリング反応のために使用することができます。 </li><li>プロを決定するためにタンパク質溶液の少量（数ml）を保持<html>テイン濃度および結合効率の計算（セクション2を参照）。 </li></ol></li></ol></li><li>タンパク質カップリング工程： <ol><li>遠心分離（2分、微量で16,000 XG）によって活性化ビーズをペレット化し、新鮮な滅菌PBS 1 mlに一回ペレットを洗浄。 </li><li>所望のタンパク質濃度を与えるように、調製したタンパク質溶液（ 例えば 、1 ml）にペレットを再懸濁。 注：カップリング工程中のタンパク質濃度は平均カップリング効率（結合効率のための決意セクション2を参照）、（1.1.4.3で計算されるように）所望の結合密度に依存します。カップリング工程中のタンパク質濃度は約6mmであるべきであるので、効率は、約85％と10倍ビーズ懸濁液中の所望の最終濃度5 mMです。 </li><li>以下の式を使用してカップリング密度を計算します。 JPG &quot;/&gt;ここで、 ρcの結合密度[タンパク質分子の数/ nmで2] タンパク質濃タンパク質濃度[mg / mlの】 タンパク質M、タンパク質分子量[ダ] ワット ビーズ濃ビーズ濃度[ビーズの数/ L]、 Dビーズ直径[NM 2] アボガドロ数</li><li>平均リガンド間隔を計算するために、結合密度を使用します。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li>回転ホイール上で25℃で2時間のためのタンパク質 - ビーズ懸濁液をインキュベートします。 注：一部のタンパク質は、室温で安定していない可能性があります。これらの場合、反応は4°CO / Nで行うことができます。 </li><li> 50mMの最終濃度にシステインストックを添加することによって、ビーズ上の残りの活性基を失活し、回転ホイール上で25℃で30分間、懸濁液をインキュベートします。遠心分離（2分、微量で16,000 XG）によりビーズをペレット化。 </li><li>タンパク質濃度との結合効率の計算を決定するために、上清を保持し（セクション2を参照）。 </li><li>最終生成物を得た新鮮なPBS 1ml中に1mlのPBS再懸濁で二回ビーズペレットを洗浄します。 注：上記の手順は、通常、次の実験のための10×ストックとして使用することができる5mMのタンパク質、（セクション3参照）の最終濃度で、結合したタンパク質を1ml​​を与えます。 </li><li>プロトコルのセクション3に進むには、ビーズストックの100ミリリットル/ mlの仕事、または500 nmのタンパク質の最終濃度で。注：このprocedurための良い出発点eは2 nm以下、直径2mmのビーズ上の57ナノメートルの平均間隔は3×10 -4タンパク質/平均結合密度が得られ、2×10 12ビーズ/ mlとなります。 </li></ol></li></ol></li><li>チオールカルボキシ方向性結合 注意：このプロトコルは、カルボキシル官能化ポリスチレンビーズのタンパク質を含有するシステインを結合するのに適しています。カルボキシル部分は、最初に、修正されたアミン、次 ​​に架橋スルホSMPB（ 図2）を用いて、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）/ N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を用いて活性化されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> 図2架橋ポリマービーズへのタンパク質の方向性チオールカルボキシルカップリングのために使用される戦略である。カルボキシル化ポリスチレンビーズは、最初にEDCで活性化し、半安定NHSエステルを形成するために、NHSで修飾されています。 ethylenediのその後のアミンカップリングスルホSMPBと反応する遊離アミン基、アミン結果。マレイミドは、ビーズが、その後ビーズに方向性結合タンパク質に遊離システインと反応することができる活性化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol><li>試薬の調製： <ol><li> PBS（100 mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH7.0）で、オートクレーブを準備します。 </li><li>使用直前のTCEP（PBS中0.5 Mまたは287 mg / mlの、）100×ストックを準備します。 </li><li>使用直前に、EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の10Xストック（20mMの、またはPBS中に4mg / ml）を準備します。 </li><li> 10倍株式のNHS（PBS中の50mM、または6 mg / mlの）（N-ヒドロキシ）使用直前に準備をします。 </li><li>使用直前に5倍の株式（10 mm以上の dH 2 O中4.58 mg / mlの）スルホSMPBのを準備します。 </li><li>システインの10倍の株価（500 mm以上のPBS、pH7.0の中で88 mg / mlの）を準備し、すぐにBEFORE使用。 </li></ol></li><li>ビーズの活性化： <ol><li>静かに反転させてビーズ懸濁液を混合し、1ミリリットル滅菌PBS、pHが7.0を含む滅菌1.5mlチューブにビーズ懸濁液（例えば、12ミリリットル）の必要量を転送します。 </li><li>静かに微量（16,000×gで2分間）で遠心分離することにより、ビーズ、ペレットを洗浄するために上下にピペットと。 </li><li>慎重にピペットで上清を除去し、廃棄します。 </li><li>新鮮な滅菌PBS 1mlにビーズペレットを再懸濁し、洗浄工程を繰り返します。 </li><li> PBS 0.8 ml中にビーズペレットを再懸濁。 </li><li> 10倍のEDCの株式の100ミリリットル（2 mMの最終濃度）とビーズ懸濁液に10倍のNHSストック溶液（5 mMの最終濃度）の直後に100ミリリットルを追加します。 </li><li>回転ホイール上で25℃で30分間、ビーズ懸濁液をインキュベートします。 </li><li>一度0.8ミリリットルでPBSおよび再懸濁し、1mlの新鮮な滅菌PBSでビーズを洗浄します。 </li><li> 200ミリリットルエチレンジアミンを追加し、INC回転ホイール上で25℃で1時間のためのビーズ懸濁液をubate。 </li><li> 1mlのPBSで一回ビーズを洗浄し、新鮮なPBS 0.8 ml中にビーズを再懸濁します。 </li><li>セクション1.1.2で説明したようにセクション1.1.2.4（スルホSMPBとビーズ活性化）から進み、セクション1.1（チオール - アミン方向性結合）に記載されているプロトコルの残りの部分に従ってください。 1.1節で説明したものと同一の方法で、タンパク質調製物とタンパク質カップリング手順を実行します。 注：（約75％）は、このプロトコルを使用する典型的なカップリング効率は、従って、同一の結合密度を達成するために、それに応じて、最初のタンパク質濃度を調節セクション1.1と比較して、わずかに低いです。 </li></ol></li></ol></li></ol>結合効率の2決意注：以下のようにブラッドフォード試薬10と比色アッセイ、タンパク質濃度を決定するために使用します。 <ol><li>静かEにブラッドフォード試薬を反転<html>試薬のnsure均一。 </li><li> 10 mg / mlのBSAストック溶液を用いて、緩衝液中で0.1〜1.5 mg / mlのBSAの濃度をカバーするタンパク質標準を準備します。 </li><li> 96ウェルプレートのウェルにブラッドフォード試薬の250ミリリットルを追加します。 （緩衝液のみ）すべてのサンプル、タンパク質標準および陰性対照のための十分な井戸を準備します。 </li><li> 96ウェルプレート中の試薬に（ネガティブコントロールのためのタンパク質標準またはバッファ）タンパク質試料の5ミリリットルを追加します。 </li><li>室温で10分間、オービタルシェーカー上でプレートをインキュベートします。 </li><li>プレートリーダーを用いて595 nmの吸光度を測定します。 </li><li> A595 nmの対BSA濃度の標準曲線を作成し、初期および上清サンプル中のタンパク質濃度を決定するために、これを使用しています。 </li><li>次のように結合したタンパク質の濃度を計算します。 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li>などのカップリング効率を計算します。 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol>競合アッセイでビーズ結合アドヘシンの3. <ol><li>調製： <ol><li>細胞は、実験前に開始し、約80％コンフルエンシーに到達させるために24ウェルプレートにシード15万細胞/ mlの濃度でHeLa細胞のウェルあたり1 mlの競合アッセイの前日、。 </li><li>三連で各実験条件を設定します。ネガティブコントロールのウェル（競合アッセイの間に追加された細菌なし）、陽性対照および（細胞毒性実験のための）溶解コントロール（のみの競合アッセイの間に追加された融合タグに結合された制御ビーズ）が挙げられます。 </li><li> Vの新鮮なコロニーを5ミリリットル海洋LB（MLB）培養物に接種腸炎と揺れ、30℃でO / Nを育てます。 </li><li>部1（カップリング）で説明したように、十分なビーズ結合MAMを準備します。ウェル当たり10倍のビーズストックの100ミリリットルのために許可します。 </li></ol></li><li>競合アッセイ： <ol><li> competitの日にイオン実験は、細菌培養物のOD 600を測定します 。 </li><li>添加剤を含まない無色のDMEMに細菌培養物を希釈することにより、感染培地を用意し、10％（v / v）のビーズ懸濁液を含む37℃、（アドヘシン結合ビーズまたはコントロールビーズのいずれか）に予め温め、1ミリリットルを準備し10のMOIを与えること/ウェルとサンプルあたり10〜20％の過剰量。注：上記の条件（24ウェルプレート、 腸炎ビブリオ 、10 MOI）、O / N培養の必要量について培養3 / OD 600として計算されたウェル（ミリリットル/ ml）をあたりに添加されます。例えば、感染培地1mlを、典型的には、細菌培養の数mlを100 mlのビーズ懸濁液を含み、無色、非補充DMEMで1 mlまでなされます。 </li><li>井戸から古い培地を除去し、各ウェルに37℃に予め温めておいた滅菌PBSを1mlを追加することで、培養したHeLa細胞を洗います。 </li><li> PBSを削除して、ウェル当たりの感染培地1mlを加えます。また、ソリューションの続きを加えることで、コントロールを設定0.1％トリトンX-100（細胞毒性の測定のために、唯一の必要な溶解制御）を含有する対照ビーズおよび細菌（陽性対照）または付着ビーズおよび細菌なし（陰性対照）、またはDMEMをaining。 </li><li>所望の時間（例えば、細胞毒性の測定のために4時間、または接着の測定のために1時間）37℃で組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートします。 注：宿主細胞における細菌の接着および細胞毒性の両方は阻害の有効性のために読みアウトとして使用することができます。細胞毒性および接着の測定の時点とが一致した場合、細胞毒性は、培養上清を使用して決定されるので、両方のアッセイは、同一のウェルからのサンプルを用いて行ってもよいし、付着アッセイは、残りの細胞層に由来するサンプルを使用。 </li></ol></li><li>細胞毒性の測定： <ol><li>示された時点（ 例えば 、4時間後に感染症）で、各24ウェルから3回200ミリリットルを削除してに転送96ウエルプレート。 </li><li> 1,500×gで96ウェルプレートを回転、5分間よく新鮮な96ウェルプレートにそれぞれから100 mlのを転送します。 （これらはブランクとして使用されます）三連で96ウェルプレートのウェルに新鮮な感染実験の際に使用されるメディアの100ミリリットルを追加します。 </li><li> LDH細胞毒性検出キットを用い、製造業者の説明書に従って、乳酸脱水素酵素（LDH）放出アッセイを行います。 <ol><li>簡単に述べると、25単位で必要な試薬の量を計算する（62サンプルが測定される場合、例えば 、75などのための十分な試薬混合物を構成します）。 </li><li>例えば、100サンプルに対して、試薬Bの反転の250μlの試薬Aの11.25ミリリットルを混ぜ、発泡避けるために渦をしないでください。 </li><li>マルチチャンネルピペットでピペッティングすることができるように容器内の混合物を入れてください。各サンプルに100μlの試薬混合物を追加します。 </li><li>室温でプレートをインキュベートし、10、20、30分でプレートリーダーで490 nmの吸光度を読み取ります。 </lI&gt; <li>溶解コントロールサンプルの吸光度が高いが、それでもプレートリーダー（典型的には、2-3吸光度単位）の線形範囲内にあるために、データセットを分析します。 </li><li>変換のために次の式を使用して、％細胞毒性として結果を表現します： <img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li>細菌付着の測定： <ol><li>示された時点（ 例えば 、1時間後に感染症）で、細胞層からメディアを削除します。 </li><li>徹底的に任意の非付着細胞を除去するために、滅菌、予め温めておいたPBS（1mlのPBSそれぞれの少なくとも3〜4回の洗浄）で細胞層を洗浄します。 </li><li>ウェルあたりPBS中のTriton X-100溶液vの/無菌の1％vの1ミリリットルを添加することにより溶解する宿主細胞。 5分間37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>各サンプルを上下に数回、1.5 mlチューブを分離するために、各ウェルの内容を転送する前にピペット。サンプルの10倍連続希釈液を調製します無菌PBSに（例えば、サンプルの100ミリリットルのPBS 900ミリリットルを使用します）。 </li><li>プレートMLB寒天上で、各サンプルの100 mlの細胞スプレッダーを用いて広げました。細菌株および時点に応じて、プレートに希釈をする最適化します。注：記載された実験のセットアップについては、10 5または10 6倍希釈は、CFUの適切な数を与えます。 </li><li> 37°のCO / Nでプレートをインキュベートし、コロニー計数によって細菌を列挙。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

本明細書において、我々は、それぞれ、ポリスチレンビーズのアミン - またはカルボキシレート変性に結合チオール含有タンパク質に使用することができる2つのプロトコルを説明します。手順の容易さ、チオール、アミンカップリングであることが好ましいが、所望のビード仕様（直径、蛍光特性）に応じて、アミン官能化ビーズを使用することはできない場合があり、我々は、したがって、カルボン酸に変換するプロトコルが含まれています - アミン部分に研究者に足場の選択に最大限の柔軟性を提供します。タンパク質を含有する任意のシステインのためのチオール、アミンおよびチオールカルボキシル結合作業の両方が、方向性結合（すなわち、表面ディスプレイを模倣するそのN末端 ​​あたりタンパク質の固定化）をGST融合物として生成されたシステイン残基なしでタンパク質を必要としますタンパク質、またはそれは部位特異的突然変異誘発によって導入された単一の末端システイン残基が含まれています。複数の反応性システインが含まれている場合タンパク質内で、このタンパク質の機能を妨げることがあり、ランダムな固定化につながります。多くの細菌の付着は自然にシステインが含まれていません。これは、天然の構造および機能は、変異体に保持されるように広範囲のアッセイを必要とするが、他のもののために、これらは、部位特異的突然変異誘発により除去することができます。 GST融合タンパク質を、ビーズに結合した精製GSTタグは、適切な陰性対照として使用することができます。これらは多くの場合、一緒に凝集または非特異的に細胞に付着する高い傾向を持っているように、対照として非結合ビーズを使用することは、避けるべきです。プロトコル1.2の単純化されたバージョンのみEDCを用いたが、ただし、この場合、結合は、タンパク質中の第一級アミンを介して行われるので、方向性結合を保証しない、カルボキシル官能性ポリマービーズに結合するタンパク質を使用することができます。 還元剤としてTCEPは、dithiothrなど、他の市販されており、一般的に使用される還元剤に置き換えてはいけませんeitol（DTT）または2-メルカプトエタノール（BME）、その中に含まれるチオールは、チオール - マレイミドカップリング工程でタンパク質の結合と競合するように。 PBSは、他のバッファに置き換えてもよいが、次の考慮事項に：バッファは第一級アミンを含めることはできません（そうトリス含有緩衝液は適していません）。非常に低い（&lt;10mMの）塩濃度を含むバッファーの使用は、凝集をビーズにつながり、また避けるべきです。タンパク質の純度は、純粋なタンパク質を使用する必要があり、この手順の間に考慮すると、高品質のデータを達成するために重要な因子です。我々は、日常的に少なくともアフィニティー精製およびゲル濾過工程を含む多段階でタンパク質を精製し、場合によっては、イオン交換クロマトグラフィーは、第三の工程として行われます。 SDS-PAGEによって判断されるように、結果としてカップリングに使用されるタンパク質の純度は、通常90％以上です。 それは、目のと同様に、最初の反応混合物中の両方のタンパク質濃度を決定することをお勧めします反応終了後の電子上清。これは、見かけ上、ビーズ結合タンパク質の濃度、ひいてはカップリング密度を決定するのに役立ちます。両方の値の決意も、カップリング効率の計算を可能にします。所望の最終濃度とカップリング密度を達成するために、その後の反応における最初のタンパク質溶液を調製するときに考慮することができます。反応中の物質のいずれも使用される濃度での色素複合体形成を妨害しないようにブラッドフォード試薬は、カップリング反応の前および後のタンパク質濃度の決意に特に適しています。低いタンパク質濃度が使用される場合、この方法は、より高感度な検出法で交換する必要がある可能性があり、しかし、注意は、カップリング反応の中に含まれる物質と相溶性でなければならないという事実に支払わなければなりません。それはまた、注意して粉末状の試薬 ​​を新たに調製した試薬を使用して処理するために推奨される（例えば、店密閉容器内と試薬の品質は、結合効率に影響を与えるため）に水分を描画する試薬を回避するために、シリカビーズを使用します。カップリング効率は、予想よりも低い場合には、可能な治療薬は、最初のビーズおよびタンパク質濃度の増加が挙げられます。より高い濃度が使用されている場合は、カップリング試薬の濃度が比例して増加するのに十分なモル過剰量を確保しなければなりません。ビーズ/タンパク質濃度を変更すると、通常、より良い最適化への第一歩ではなく、反応時間が増加しています。ビーズカップリングのためのプロトコルは長いですので、我々は一般的に材料の大規模なバッチを準備します。懸濁液のアリコートを液体窒素中でスナップ凍結し、数ヶ月間-20℃で保存することができます。解凍した溶液は、再凍結すべきではないし、4℃に保ち、1〜2日以内に使用する必要があります。しかし、これは、最初に小さなバッチでテストすべきであるとして使用されるタンパク質の性質および安定性に応じて変化します。 腸炎ビブリオとヘラ上皮細胞の感染を阻害するために、ビーズ結合MAMSの容量を測定するために実施または読み出しとして細胞毒性を減少させます。両方の場合において、製剤及び競合アッセイは、同じプロトコルに従います。 Vの読み出しに応じて、異なる株腸炎が使用されている ：POR1は細胞毒性を測定するために使用される細胞毒性菌株を、非細胞毒性株POR2が細菌付着を測定するために使用されている間、細胞死および細胞の剥離が付着した細菌を定量化するための手順を損なうからです。 当初、コンペtition実験は、宿主細胞が細菌を添加する前にビーズとプレインキュベートした最初の段階的なプロトコルとして設定しました。 V.について腸炎 、使用するビーズの仕様（MAM7に結合された2μmのビーズ）を、ビーズおよび細菌の両方が得られる細胞毒性の変化なしに同時に添加することができる。 すなわち、この実験では、ビーズは、結合、宿主細胞のための細菌を負かします。使用細菌種およびビード形状に応じて、二つの別々のステップとして、ビーズの付着や細菌感染を維持するための十分な理由があるかもしれません。例えば、非運動性細菌で細胞を感染させるために、プレートは、一般に、感染培地を加えた後、遠心分離します。これは、細胞膜上にビーズの非常に不均一な分布をもたらすので、ビーズ懸濁液を含むプレートを遠心分離は、避けるべきです。より小さい粒子サイズが使用されている場合、ビーズは、細胞表面上に沈降する時間がかかります。その場合においてSUfficient時間は、感染前にビーズ結合のために許可する必要があります。読み出しとして細菌付着が使用される場合、細胞剥離及び溶解が付着した細菌の定量化を損ない得るように、サンプルは、宿主細胞が著しく感染株によって損傷されていない時点で取られるべきです。 代わりに希釈プレーティングすることによって細菌の付着を列挙のサンプルは、代替的に（ 図5）画像化のために処理されてもよいです。この場合には、組織培養細胞を、ガラスカバースリップ上に播種し、直接ではなくウェルにすべきです。また、蛍光タンパク質を発現する蛍光ビーズおよび細菌感染、特定の宿主細胞マーカーと共に使用することができます。例えば、競合実験は、一般的に、宿主細胞のアクチン細胞骨格の染色、蛍光青色ビーズおよび蛍光と共に、感染に起因する形態学的変化を評価するために、蛍光赤ローダミン - ファロイジンを用いて画像化されます緑（GFPを発現またはSYTO18染色）細菌。 黄色ブドウ球菌 FnBPA、 ストレプトコッカス・ピオゲネス F1 FUDと腸炎ビブリオの MAMを含むビーズに結合アドヘシンの範囲は、接着、接着阻害および病原体媒介性細胞傷害1、図7、図8との密着性の寄与を研究するための生体模倣材料として使用されています。足場として使用されるポリマービーズは、色（例えば、青色蛍光赤、青、緑、オレンジ）の広い範囲で利用可能であるので、このアプローチを使用する利点の一つは、添付イベントの視覚化の容易さです。したがって、機能を妨げる可能性が直接タンパク質標識は、回避することができます。このように可溶性タンパク質と比較して、より生理学的に関連する立体構造を反映さらに、表面結合模倣細菌表面上の付着の多価ディスプレイを。 無傷の細菌やbacteriを用いた研究と比較するとらの変異体は、ビーズのアプローチは、細菌増殖に関連する問題を回避します。増殖培地および栄養枯渇の酸性化は、負の宿主細胞に影響を与え、細菌の複製は、最終的には妥協-例えば、無傷の細菌を用いて細胞をホストする細菌付着の長期（ 例えば、O / N）の研究は、多くの場合、細菌の増殖を伴う現象によって危険にさらされています結像品質。 より最近では、ビーズに結合したアドヘシンの使用は、細菌付着の下流のプロセスのシグナリングに関与する宿主細胞因子の親和性精製の ​​ためのツールとしてのそれらの使用を含むように拡張されている。V.腸炎 MAM7は、宿主細胞膜におけるホスファチジン酸への結合を介して、RhoAの活性化およびアクチン再配列1,3をトリガする 。MAM結合ビーズを精製し、MAM-宿主細胞の結果として組み立てシグナリングプラットフォームに関与するタンパク質を同定するために使用されています結合。ビーズができるので、簡単に短い遠心分離工程によって上清から分離され、そして目的のタンパク質を共有結合的に結合され、これは、夾雑タンパク質からの分離を達成するための優れた方法であり、そのようなプロテオミクスまたはウェスタンなどの下流の用途に使用することができ、関連するタンパク質複合体を、豊かブロッティング。

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td>Danger; corrosive&lt;br/&gt; can be bought as solution or freshly prepared</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td><td>Fisher</td><td>PN22317</td><td>Danger; toxic</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>30089</td><td>Danger; toxic</td></tr><tr><td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&amp;nbsp;&amp;mu;m mean particle size</td><td>Sigma</td><td>L0280</td><td>harmful;&lt;br/&gt; a range of alternative particle sizes and colors is available</td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td><td>Thermo scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td><td>Sigma</td><td>CLB9</td><td>harmful;&lt;br/&gt; a range of alternative particle sizes and colors is available</td></tr><tr><td>Ethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>E26266</td><td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Promega</td><td>W3841</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td>Danger; corrosive and toxic</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&amp;nbsp;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>for infection experiments</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>for maintenance of cultured host cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>supplement for tissue culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin -&lt;br/&gt; Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&amp;nbsp;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>supplement for tissue culture medium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>LDH Cytotoxicity detection kit</td><td>Takara</td><td>MK401</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>reagent reservoirs (25ml)</td><td>SLS</td><td>F267660</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner</td><td>655182</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>haemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tissue culture facilities</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>multichannel pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

V.腸炎付着MAM7は、ホスト表面受容体の認識に関与する7タンデム哺乳類細胞侵入（MCE）ドメインを含みます。我々は、精製されたフラグメントは、V.と競合するこれらの材料の能力を試験するために、すべての7タンデムMCEドメイン（MAM7）または最初MCEドメイン（MAM1）のいずれかを包含する、組換えに結合されたポリスチレンビーズを使用しました結合宿主細胞のための腸炎及び接着阻害剤としてのこれらの材料の結果として得られる効果。 HeLa細胞を感染させたV. in vitroでの感染から生じる腸炎株 POR1、および細胞傷害性は、4時間（ 図3）後に評価しました。 0.1％トリトンX-100（正の溶解制御）によるHela細胞の処理完全な細胞溶解をもたらし、非感染細胞は細胞毒性の非常に低いレベルを示した。 インビトロ POR1と未処理の細胞の感染は、細胞溶解の非常に高いレベルをもたらし、そしてこのMAM7 - コによって阻害されましたupledビーズではなくMAM1結合またはGST-結合された制御ビーズ（ 図3）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> 腸炎ビブリオの図3.キャラは競合アッセイの間、上皮細胞における細胞毒性を誘導した。細胞をVで処理しました異なる競合する事業体の存在下で示されるように- 腸炎 （VP）は、（+）で示されていない、または全く細菌（）（COMP）。これらには、COMPのどちらかが含まれていません。 （ - ）、MAM7ビーズ（MAM7）、MAM1ビーズ（MAM1）またはGSTコントロールビーズ（GST）。対照として、細胞をトリトンX-100（トリトン、溶解制御）のいずれかで処理した、または感染していない（uninf）に放置しました。 4時間後のLDH放出はセクション3で説明したように測定し、そして上記のように、結果は、トリトン対照（100％）とブランク（0％）に対して正規化しました。結果は、三連の実験からの平均±SEMで。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> Vの列挙MAM7-、MAM1-、またはGSTコントロールビーズとインキュベートした未処理のHeLa細胞、または細胞のいずれかに接続されている腸炎は 、MAM7ビーズことを明らかにしたが、MAM1-またはGST-制御ビーズは、Vを負かすありません細胞表面受容体（ 図4）をホストに取り付けるための腸炎 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> 競合実験中に細菌付着の図4キャラクタリゼーション。HeLa細胞を感染させたV. （ - ）非存在下における腸炎 POR2（VP +）、または競合実体の存在、以下のように（COMP。）：MAM7ビーズ（MAM7）、MAM1ビーズ（MAM1）またはGSTコントロールビーズ（GST）を。細菌付着のように、1時間後に測定しました<html>セクション3に記載した結果は、三連の実験からの平均±SEMで。手段（CFU / mlの中FLTR）が2.3010 6、1.5310 5、2.0510 6、2.1210 6です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> フルオロフォア標識されたビーズに結合されたアドヘシンは、宿主細胞への細菌の付着を模倣した （図5）は、細胞イメージングのための強力なツールである物質の生成につながります。 MAM7結合青色蛍光ビーズを使用して、我々は、上皮細胞にMAM7媒介添付ファイルのプロセスを特徴とします。宿主細胞に対するMAM7の結合は、F-アクチン（ 図5B）のために染色するためにローダミン-ファロイジンを用いた共可視化したストレスファイバーのアクチン再構成および形成されました。 _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; ヒーラにMAM7結合ビーズの図5の調製およびフルオロフォアの使用は青色蛍光バイオミメティックビーズの（A）サスペンション （右チューブ、10倍株式）。画像化目的のためにバイオミメティックビーズを標識し、コントロール（左チューブ）をバッファリングする。（B）アタッチメントアクチン再構成及びストレスファイバー形成の細胞をもたらします。 （ローダミン - ファロイジンで染色した赤、）青色蛍光ビーズの添付ファイルと結果のアクチンストレスファイバーは、顕微鏡によって画像化しました。バー、10μmです。パネルBの画像はリムら 1から適応し、クリエイティブコモンズのライセンスの下で再現された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K ビュー.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

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Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

生化学

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

免疫・感染学

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical imaging. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometry represents a label-free, in situ imaging modality capable of generating spatial maps for a wide variety of metabolites. While thinly sectioned tissue samples are now routinely analyzed via this technology, imaging mass spectrometry analyses of non-traditional substrates, such as bacterial colonies commonly grown on agar in microbiology research, remain challenging due to the high water content and uneven topography of these samples. This paper demonstrates a sample preparation workflow to allow for imaging mass spectrometry analyses of these sample types. This process is exemplified using bacterial co-culture macrocolonies of two gastrointestinal pathogens: Clostridioides difficile and Enterococcus faecalis. Studying microbial interactions in this well-defined agar environment is also shown to complement tissue studies aimed at understanding microbial metabolic cooperation between these two pathogenic organisms in mouse models of infection. Imaging mass spectrometry analyses of the amino acid metabolites arginine and ornithine are presented as representative data. This method is broadly applicable to other analytes, microbial pathogens or diseases, and tissue types where a spatial measure of cellular or tissue biochemistry is desired.

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

A novel sample preparation method is demonstrated for the analysis of agar-based, bacterial macrocolonies via matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry.

イメージング質量分析 による 寒天上および感染組織内で増殖した細菌コロニーの微生物連携の検討

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

微生物相互作用の調査のための高スループット共培養アッセイ

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in bacterial infections and constitutes a hallmark of potential threat. Therefore, examining the adherence of bacteria to host cells can be used as a component of bacterial threat assessment. A standard method for enumerating bacterial adherence to host cells is to co-incubate bacteria with host cells, harvest the adherent bacteria, plate the harvested cells on solid media, and then count the resultant colony forming units (CFU). Alternatively, bacterial adherence to host cells can be evaluated using immunofluorescence microscopy-based approaches. However, conventional strategies for implementing these approaches are time-consuming and inefficient. Here, a recently developed automated fluorescence microscopy-based imaging method is described. When combined with high-throughput image processing and statistical analysis, the method enables rapid quantification of bacteria that adhere to host cells. Two bacterial species, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Listeria monocytogenes and corresponding negative controls, were tested to demonstrate the protocol. The results show that this approach rapidly and accurately enumerates adherent bacteria and significantly reduces experimental workloads and timelines.

Detection of host-bacterial pathogen interactions based on phenotypic adherence using high-throughput fluorescence labeling imaging along with automated statistical analysis methods enables rapid evaluation of potential bacterial interactions with host cells.

ホスト細胞への細菌の付着を自動的に、ハイスループットで検出

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

生物学

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While in-house grown 2D epithelial monolayers lack true representation of the in vivo situation, commercially available tissue models are often overlooked due to their cost and practicality. However, with careful planning, such models provide reproducible platforms for a vast array of different applications. Here, we report the use of epithelial models that can be utilized for a wide variety of experimental purposes to investigate host-pathogen interactions in various ecological niches, such as the oral cavity, skin, and vaginal mucosa. From simple planktonic cells to complex biofilm co-culture, epithelial models are used to assess microbial adherence and invasion, and to evaluate the host response at a transcriptional and/or protein level, with scope for more detailed profiling using different omics approaches. Furthermore, these biological systems can be used as more accurate test beds for evaluating conventional and novel antimicrobial activity in a complex host-pathogen microenvironment in vitro. The protocols described herein document how models are handled upon arrival and prepared in the laboratory for co-culture stimulation with biofilm communities. The methods detail how experimental outputs are achieved from the model systems, including the processing of tissue, the co-culture setup, and data generation. These experiments include host gene expression through single- and multiplex qPCR analyses and inflammatory protein detection using ELISAs. In conclusion, epithelial models provide useful in vitro systems for preclinical investigatory studies into simple or complex host-pathogen interactions.

The present protocol outlines the application of organotypic tissue models for investigating host-pathogen interactions in vitro. Specifically, the model system described uses a multi-layered oral epithelium exposed to microorganisms associated with biofilms (dental plaque) within the context of oral health versus disease.

In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

要約

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培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

イメージング質量分析による寒天上および感染組織内で増殖した細菌コロニーの微生物連携の検討

微生物相互作用の調査のための高スループット共培養アッセイ

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

ホスト細胞への細菌の付着を自動的に、ハイスループットで検出

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

要約

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培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

イメージング質量分析 による 寒天上および感染組織内で増殖した細菌コロニーの微生物連携の検討

微生物相互作用の調査のための高スループット共培養アッセイ

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

ホスト細胞への細菌の付着を自動的に、ハイスループットで検出

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

イメージング質量分析による寒天上および感染組織内で増殖した細菌コロニーの微生物連携の検討