The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

ポリマービーズへのタンパク質の1。化学カップリング<ol><li>チオールアミン方向性結合 注意：このプロトコルは、タンパク質が、スルホスクシンイミジル4-（p個の -maleimidophenyl）ブチレート架橋剤として（スルホSMPB）（ 図1）を使用して 、ポリマービーズを官能アミンを含有するシステインの結合に適しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> 図1の架橋ポリマービーズへのタンパク質の方向性チオール-アミンカップリングのために使用される戦略を。アミン変性ポリスチレンビーズは、スルホSMPBで活性化されています。マレイミドは、ビーズに方向性結合タンパク質に遊離システインと反応する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol><li>試薬の調製： <ol><li> PBS（100 mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH7.0）で、オートクレーブを準備します。 </lI&gt; <li>使用直前に100倍の株式TCEP（トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン）の（PBS中0.5 Mまたは287 mg / mlの）を準備します。 </li><li>使用直前に5倍の株式（10 mm以上の dH 2 O中4.58 mg / mlの）スルホSMPBのを準備します。 </li><li>使用直前にシステイン（PBS、pHを7.0 mlの500 mMのか、88ミリグラム/）10倍の在庫を準備します。 </li></ol></li><li>ビーズの活性化： <ol><li>静かに反転させてビーズ懸濁液を混合し、1ミリリットル滅菌PBS、pHが7.0を含む滅菌1.5mlチューブにビーズ懸濁液（例えば、12ミリリットル）の必要量を転送します。 </li><li>静かに微量（16,000×gで2分間）で遠心分離することにより、ビーズ、ペレットを洗浄するために上下にピペットと。 </li><li>慎重にピペットで上清を除去し、廃棄します。新鮮な滅菌PBS 1mlにビーズペレットを再懸濁し、洗浄工程を繰り返します。 PBS 0.8 ml中にビーズペレットを再懸濁。 </li><li> 、新たに調製した10mMのスルホSMPBの200ミリリットルを追加し、最終的なコンセントを与えること2 mMのの比。 </li><li>回転ホイール上で25℃で1時間のためのビーズ懸濁液をインキュベートします。 </li></ol></li><li>タンパク質の削減： <ol><li>それはすぐに活性化したビーズに添加することができるように、活性化工程のインキュベーション期間中、次のカップリング工程のためのタンパク質を調製します。 注：この還元工程は、常に、GST（グルタチオンSトランスフェラーゼ）融合タンパク質のために必要とされていないが、それは高い結合効率を確保することをお勧めします。 <ol><li>タンパク質濃度を確認し、カップリング反応に必要な最終濃度に調整。注：PBSで6 mMのタンパク質、および1 mlの容量は、通常使用されています。 </li><li> 5 mMのの最終濃度を得TCEPの株式を追加します。 RTで30分間溶液をインキュベートします。 注：反応混合物を直接、次のカップリング反応のために使用することができます。 </li><li>プロを決定するためにタンパク質溶液の少量（数ml）を保持<html>テイン濃度および結合効率の計算（セクション2を参照）。 </li></ol></li></ol></li><li>タンパク質カップリング工程： <ol><li>遠心分離（2分、微量で16,000 XG）によって活性化ビーズをペレット化し、新鮮な滅菌PBS 1 mlに一回ペレットを洗浄。 </li><li>所望のタンパク質濃度を与えるように、調製したタンパク質溶液（ 例えば 、1 ml）にペレットを再懸濁。 注：カップリング工程中のタンパク質濃度は平均カップリング効率（結合効率のための決意セクション2を参照）、（1.1.4.3で計算されるように）所望の結合密度に依存します。カップリング工程中のタンパク質濃度は約6mmであるべきであるので、効率は、約85％と10倍ビーズ懸濁液中の所望の最終濃度5 mMです。 </li><li>以下の式を使用してカップリング密度を計算します。 JPG &quot;/&gt;ここで、 ρcの結合密度[タンパク質分子の数/ nmで2] タンパク質濃タンパク質濃度[mg / mlの】 タンパク質M、タンパク質分子量[ダ] ワット ビーズ濃ビーズ濃度[ビーズの数/ L]、 Dビーズ直径[NM 2] アボガドロ数</li><li>平均リガンド間隔を計算するために、結合密度を使用します。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li>回転ホイール上で25℃で2時間のためのタンパク質 - ビーズ懸濁液をインキュベートします。 注：一部のタンパク質は、室温で安定していない可能性があります。これらの場合、反応は4°CO / Nで行うことができます。 </li><li> 50mMの最終濃度にシステインストックを添加することによって、ビーズ上の残りの活性基を失活し、回転ホイール上で25℃で30分間、懸濁液をインキュベートします。遠心分離（2分、微量で16,000 XG）によりビーズをペレット化。 </li><li>タンパク質濃度との結合効率の計算を決定するために、上清を保持し（セクション2を参照）。 </li><li>最終生成物を得た新鮮なPBS 1ml中に1mlのPBS再懸濁で二回ビーズペレットを洗浄します。 注：上記の手順は、通常、次の実験のための10×ストックとして使用することができる5mMのタンパク質、（セクション3参照）の最終濃度で、結合したタンパク質を1ml​​を与えます。 </li><li>プロトコルのセクション3に進むには、ビーズストックの100ミリリットル/ mlの仕事、または500 nmのタンパク質の最終濃度で。注：このprocedurための良い出発点eは2 nm以下、直径2mmのビーズ上の57ナノメートルの平均間隔は3×10 -4タンパク質/平均結合密度が得られ、2×10 12ビーズ/ mlとなります。 </li></ol></li></ol></li><li>チオールカルボキシ方向性結合 注意：このプロトコルは、カルボキシル官能化ポリスチレンビーズのタンパク質を含有するシステインを結合するのに適しています。カルボキシル部分は、最初に、修正されたアミン、次 ​​に架橋スルホSMPB（ 図2）を用いて、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）/ N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を用いて活性化されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> 図2架橋ポリマービーズへのタンパク質の方向性チオールカルボキシルカップリングのために使用される戦略である。カルボキシル化ポリスチレンビーズは、最初にEDCで活性化し、半安定NHSエステルを形成するために、NHSで修飾されています。 ethylenediのその後のアミンカップリングスルホSMPBと反応する遊離アミン基、アミン結果。マレイミドは、ビーズが、その後ビーズに方向性結合タンパク質に遊離システインと反応することができる活性化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol><li>試薬の調製： <ol><li> PBS（100 mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH7.0）で、オートクレーブを準備します。 </li><li>使用直前のTCEP（PBS中0.5 Mまたは287 mg / mlの、）100×ストックを準備します。 </li><li>使用直前に、EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の10Xストック（20mMの、またはPBS中に4mg / ml）を準備します。 </li><li> 10倍株式のNHS（PBS中の50mM、または6 mg / mlの）（N-ヒドロキシ）使用直前に準備をします。 </li><li>使用直前に5倍の株式（10 mm以上の dH 2 O中4.58 mg / mlの）スルホSMPBのを準備します。 </li><li>システインの10倍の株価（500 mm以上のPBS、pH7.0の中で88 mg / mlの）を準備し、すぐにBEFORE使用。 </li></ol></li><li>ビーズの活性化： <ol><li>静かに反転させてビーズ懸濁液を混合し、1ミリリットル滅菌PBS、pHが7.0を含む滅菌1.5mlチューブにビーズ懸濁液（例えば、12ミリリットル）の必要量を転送します。 </li><li>静かに微量（16,000×gで2分間）で遠心分離することにより、ビーズ、ペレットを洗浄するために上下にピペットと。 </li><li>慎重にピペットで上清を除去し、廃棄します。 </li><li>新鮮な滅菌PBS 1mlにビーズペレットを再懸濁し、洗浄工程を繰り返します。 </li><li> PBS 0.8 ml中にビーズペレットを再懸濁。 </li><li> 10倍のEDCの株式の100ミリリットル（2 mMの最終濃度）とビーズ懸濁液に10倍のNHSストック溶液（5 mMの最終濃度）の直後に100ミリリットルを追加します。 </li><li>回転ホイール上で25℃で30分間、ビーズ懸濁液をインキュベートします。 </li><li>一度0.8ミリリットルでPBSおよび再懸濁し、1mlの新鮮な滅菌PBSでビーズを洗浄します。 </li><li> 200ミリリットルエチレンジアミンを追加し、INC回転ホイール上で25℃で1時間のためのビーズ懸濁液をubate。 </li><li> 1mlのPBSで一回ビーズを洗浄し、新鮮なPBS 0.8 ml中にビーズを再懸濁します。 </li><li>セクション1.1.2で説明したようにセクション1.1.2.4（スルホSMPBとビーズ活性化）から進み、セクション1.1（チオール - アミン方向性結合）に記載されているプロトコルの残りの部分に従ってください。 1.1節で説明したものと同一の方法で、タンパク質調製物とタンパク質カップリング手順を実行します。 注：（約75％）は、このプロトコルを使用する典型的なカップリング効率は、従って、同一の結合密度を達成するために、それに応じて、最初のタンパク質濃度を調節セクション1.1と比較して、わずかに低いです。 </li></ol></li></ol></li></ol>結合効率の2決意注：以下のようにブラッドフォード試薬10と比色アッセイ、タンパク質濃度を決定するために使用します。 <ol><li>静かEにブラッドフォード試薬を反転<html>試薬のnsure均一。 </li><li> 10 mg / mlのBSAストック溶液を用いて、緩衝液中で0.1〜1.5 mg / mlのBSAの濃度をカバーするタンパク質標準を準備します。 </li><li> 96ウェルプレートのウェルにブラッドフォード試薬の250ミリリットルを追加します。 （緩衝液のみ）すべてのサンプル、タンパク質標準および陰性対照のための十分な井戸を準備します。 </li><li> 96ウェルプレート中の試薬に（ネガティブコントロールのためのタンパク質標準またはバッファ）タンパク質試料の5ミリリットルを追加します。 </li><li>室温で10分間、オービタルシェーカー上でプレートをインキュベートします。 </li><li>プレートリーダーを用いて595 nmの吸光度を測定します。 </li><li> A595 nmの対BSA濃度の標準曲線を作成し、初期および上清サンプル中のタンパク質濃度を決定するために、これを使用しています。 </li><li>次のように結合したタンパク質の濃度を計算します。 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li>などのカップリング効率を計算します。 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol>競合アッセイでビーズ結合アドヘシンの3. <ol><li>調製： <ol><li>細胞は、実験前に開始し、約80％コンフルエンシーに到達させるために24ウェルプレートにシード15万細胞/ mlの濃度でHeLa細胞のウェルあたり1 mlの競合アッセイの前日、。 </li><li>三連で各実験条件を設定します。ネガティブコントロールのウェル（競合アッセイの間に追加された細菌なし）、陽性対照および（細胞毒性実験のための）溶解コントロール（のみの競合アッセイの間に追加された融合タグに結合された制御ビーズ）が挙げられます。 </li><li> Vの新鮮なコロニーを5ミリリットル海洋LB（MLB）培養物に接種腸炎と揺れ、30℃でO / Nを育てます。 </li><li>部1（カップリング）で説明したように、十分なビーズ結合MAMを準備します。ウェル当たり10倍のビーズストックの100ミリリットルのために許可します。 </li></ol></li><li>競合アッセイ： <ol><li> competitの日にイオン実験は、細菌培養物のOD 600を測定します 。 </li><li>添加剤を含まない無色のDMEMに細菌培養物を希釈することにより、感染培地を用意し、10％（v / v）のビーズ懸濁液を含む37℃、（アドヘシン結合ビーズまたはコントロールビーズのいずれか）に予め温め、1ミリリットルを準備し10のMOIを与えること/ウェルとサンプルあたり10〜20％の過剰量。注：上記の条件（24ウェルプレート、 腸炎ビブリオ 、10 MOI）、O / N培養の必要量について培養3 / OD 600として計算されたウェル（ミリリットル/ ml）をあたりに添加されます。例えば、感染培地1mlを、典型的には、細菌培養の数mlを100 mlのビーズ懸濁液を含み、無色、非補充DMEMで1 mlまでなされます。 </li><li>井戸から古い培地を除去し、各ウェルに37℃に予め温めておいた滅菌PBSを1mlを追加することで、培養したHeLa細胞を洗います。 </li><li> PBSを削除して、ウェル当たりの感染培地1mlを加えます。また、ソリューションの続きを加えることで、コントロールを設定0.1％トリトンX-100（細胞毒性の測定のために、唯一の必要な溶解制御）を含有する対照ビーズおよび細菌（陽性対照）または付着ビーズおよび細菌なし（陰性対照）、またはDMEMをaining。 </li><li>所望の時間（例えば、細胞毒性の測定のために4時間、または接着の測定のために1時間）37℃で組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートします。 注：宿主細胞における細菌の接着および細胞毒性の両方は阻害の有効性のために読みアウトとして使用することができます。細胞毒性および接着の測定の時点とが一致した場合、細胞毒性は、培養上清を使用して決定されるので、両方のアッセイは、同一のウェルからのサンプルを用いて行ってもよいし、付着アッセイは、残りの細胞層に由来するサンプルを使用。 </li></ol></li><li>細胞毒性の測定： <ol><li>示された時点（ 例えば 、4時間後に感染症）で、各24ウェルから3回200ミリリットルを削除してに転送96ウエルプレート。 </li><li> 1,500×gで96ウェルプレートを回転、5分間よく新鮮な96ウェルプレートにそれぞれから100 mlのを転送します。 （これらはブランクとして使用されます）三連で96ウェルプレートのウェルに新鮮な感染実験の際に使用されるメディアの100ミリリットルを追加します。 </li><li> LDH細胞毒性検出キットを用い、製造業者の説明書に従って、乳酸脱水素酵素（LDH）放出アッセイを行います。 <ol><li>簡単に述べると、25単位で必要な試薬の量を計算する（62サンプルが測定される場合、例えば 、75などのための十分な試薬混合物を構成します）。 </li><li>例えば、100サンプルに対して、試薬Bの反転の250μlの試薬Aの11.25ミリリットルを混ぜ、発泡避けるために渦をしないでください。 </li><li>マルチチャンネルピペットでピペッティングすることができるように容器内の混合物を入れてください。各サンプルに100μlの試薬混合物を追加します。 </li><li>室温でプレートをインキュベートし、10、20、30分でプレートリーダーで490 nmの吸光度を読み取ります。 </lI&gt; <li>溶解コントロールサンプルの吸光度が高いが、それでもプレートリーダー（典型的には、2-3吸光度単位）の線形範囲内にあるために、データセットを分析します。 </li><li>変換のために次の式を使用して、％細胞毒性として結果を表現します： <img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li>細菌付着の測定： <ol><li>示された時点（ 例えば 、1時間後に感染症）で、細胞層からメディアを削除します。 </li><li>徹底的に任意の非付着細胞を除去するために、滅菌、予め温めておいたPBS（1mlのPBSそれぞれの少なくとも3〜4回の洗浄）で細胞層を洗浄します。 </li><li>ウェルあたりPBS中のTriton X-100溶液vの/無菌の1％vの1ミリリットルを添加することにより溶解する宿主細胞。 5分間37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>各サンプルを上下に数回、1.5 mlチューブを分離するために、各ウェルの内容を転送する前にピペット。サンプルの10倍連続希釈液を調製します無菌PBSに（例えば、サンプルの100ミリリットルのPBS 900ミリリットルを使用します）。 </li><li>プレートMLB寒天上で、各サンプルの100 mlの細胞スプレッダーを用いて広げました。細菌株および時点に応じて、プレートに希釈をする最適化します。注：記載された実験のセットアップについては、10 5または10 6倍希釈は、CFUの適切な数を与えます。 </li><li> 37°のCO / Nでプレートをインキュベートし、コロニー計数によって細菌を列挙。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

本明細書において、我々は、それぞれ、ポリスチレンビーズのアミン - またはカルボキシレート変性に結合チオール含有タンパク質に使用することができる2つのプロトコルを説明します。手順の容易さ、チオール、アミンカップリングであることが好ましいが、所望のビード仕様（直径、蛍光特性）に応じて、アミン官能化ビーズを使用することはできない場合があり、我々は、したがって、カルボン酸に変換するプロトコルが含まれています - アミン部分に研究者に足場の選択に最大限の柔軟性を提供します。タンパク質を含有する任意のシステインのためのチオール、アミンおよびチオールカルボキシル結合作業の両方が、方向性結合（すなわち、表面ディスプレイを模倣するそのN末端 ​​あたりタンパク質の固定化）をGST融合物として生成されたシステイン残基なしでタンパク質を必要としますタンパク質、またはそれは部位特異的突然変異誘発によって導入された単一の末端システイン残基が含まれています。複数の反応性システインが含まれている場合タンパク質内で、このタンパク質の機能を妨げることがあり、ランダムな固定化につながります。多くの細菌の付着は自然にシステインが含まれていません。これは、天然の構造および機能は、変異体に保持されるように広範囲のアッセイを必要とするが、他のもののために、これらは、部位特異的突然変異誘発により除去することができます。 GST融合タンパク質を、ビーズに結合した精製GSTタグは、適切な陰性対照として使用することができます。これらは多くの場合、一緒に凝集または非特異的に細胞に付着する高い傾向を持っているように、対照として非結合ビーズを使用することは、避けるべきです。プロトコル1.2の単純化されたバージョンのみEDCを用いたが、ただし、この場合、結合は、タンパク質中の第一級アミンを介して行われるので、方向性結合を保証しない、カルボキシル官能性ポリマービーズに結合するタンパク質を使用することができます。 還元剤としてTCEPは、dithiothrなど、他の市販されており、一般的に使用される還元剤に置き換えてはいけませんeitol（DTT）または2-メルカプトエタノール（BME）、その中に含まれるチオールは、チオール - マレイミドカップリング工程でタンパク質の結合と競合するように。 PBSは、他のバッファに置き換えてもよいが、次の考慮事項に：バッファは第一級アミンを含めることはできません（そうトリス含有緩衝液は適していません）。非常に低い（&lt;10mMの）塩濃度を含むバッファーの使用は、凝集をビーズにつながり、また避けるべきです。タンパク質の純度は、純粋なタンパク質を使用する必要があり、この手順の間に考慮すると、高品質のデータを達成するために重要な因子です。我々は、日常的に少なくともアフィニティー精製およびゲル濾過工程を含む多段階でタンパク質を精製し、場合によっては、イオン交換クロマトグラフィーは、第三の工程として行われます。 SDS-PAGEによって判断されるように、結果としてカップリングに使用されるタンパク質の純度は、通常90％以上です。 それは、目のと同様に、最初の反応混合物中の両方のタンパク質濃度を決定することをお勧めします反応終了後の電子上清。これは、見かけ上、ビーズ結合タンパク質の濃度、ひいてはカップリング密度を決定するのに役立ちます。両方の値の決意も、カップリング効率の計算を可能にします。所望の最終濃度とカップリング密度を達成するために、その後の反応における最初のタンパク質溶液を調製するときに考慮することができます。反応中の物質のいずれも使用される濃度での色素複合体形成を妨害しないようにブラッドフォード試薬は、カップリング反応の前および後のタンパク質濃度の決意に特に適しています。低いタンパク質濃度が使用される場合、この方法は、より高感度な検出法で交換する必要がある可能性があり、しかし、注意は、カップリング反応の中に含まれる物質と相溶性でなければならないという事実に支払わなければなりません。それはまた、注意して粉末状の試薬 ​​を新たに調製した試薬を使用して処理するために推奨される（例えば、店密閉容器内と試薬の品質は、結合効率に影響を与えるため）に水分を描画する試薬を回避するために、シリカビーズを使用します。カップリング効率は、予想よりも低い場合には、可能な治療薬は、最初のビーズおよびタンパク質濃度の増加が挙げられます。より高い濃度が使用されている場合は、カップリング試薬の濃度が比例して増加するのに十分なモル過剰量を確保しなければなりません。ビーズ/タンパク質濃度を変更すると、通常、より良い最適化への第一歩ではなく、反応時間が増加しています。ビーズカップリングのためのプロトコルは長いですので、我々は一般的に材料の大規模なバッチを準備します。懸濁液のアリコートを液体窒素中でスナップ凍結し、数ヶ月間-20℃で保存することができます。解凍した溶液は、再凍結すべきではないし、4℃に保ち、1〜2日以内に使用する必要があります。しかし、これは、最初に小さなバッチでテストすべきであるとして使用されるタンパク質の性質および安定性に応じて変化します。 腸炎ビブリオとヘラ上皮細胞の感染を阻害するために、ビーズ結合MAMSの容量を測定するために実施または読み出しとして細胞毒性を減少させます。両方の場合において、製剤及び競合アッセイは、同じプロトコルに従います。 Vの読み出しに応じて、異なる株腸炎が使用されている ：POR1は細胞毒性を測定するために使用される細胞毒性菌株を、非細胞毒性株POR2が細菌付着を測定するために使用されている間、細胞死および細胞の剥離が付着した細菌を定量化するための手順を損なうからです。 当初、コンペtition実験は、宿主細胞が細菌を添加する前にビーズとプレインキュベートした最初の段階的なプロトコルとして設定しました。 V.について腸炎 、使用するビーズの仕様（MAM7に結合された2μmのビーズ）を、ビーズおよび細菌の両方が得られる細胞毒性の変化なしに同時に添加することができる。 すなわち、この実験では、ビーズは、結合、宿主細胞のための細菌を負かします。使用細菌種およびビード形状に応じて、二つの別々のステップとして、ビーズの付着や細菌感染を維持するための十分な理由があるかもしれません。例えば、非運動性細菌で細胞を感染させるために、プレートは、一般に、感染培地を加えた後、遠心分離します。これは、細胞膜上にビーズの非常に不均一な分布をもたらすので、ビーズ懸濁液を含むプレートを遠心分離は、避けるべきです。より小さい粒子サイズが使用されている場合、ビーズは、細胞表面上に沈降する時間がかかります。その場合においてSUfficient時間は、感染前にビーズ結合のために許可する必要があります。読み出しとして細菌付着が使用される場合、細胞剥離及び溶解が付着した細菌の定量化を損ない得るように、サンプルは、宿主細胞が著しく感染株によって損傷されていない時点で取られるべきです。 代わりに希釈プレーティングすることによって細菌の付着を列挙のサンプルは、代替的に（ 図5）画像化のために処理されてもよいです。この場合には、組織培養細胞を、ガラスカバースリップ上に播種し、直接ではなくウェルにすべきです。また、蛍光タンパク質を発現する蛍光ビーズおよび細菌感染、特定の宿主細胞マーカーと共に使用することができます。例えば、競合実験は、一般的に、宿主細胞のアクチン細胞骨格の染色、蛍光青色ビーズおよび蛍光と共に、感染に起因する形態学的変化を評価するために、蛍光赤ローダミン - ファロイジンを用いて画像化されます緑（GFPを発現またはSYTO18染色）細菌。 黄色ブドウ球菌 FnBPA、 ストレプトコッカス・ピオゲネス F1 FUDと腸炎ビブリオの MAMを含むビーズに結合アドヘシンの範囲は、接着、接着阻害および病原体媒介性細胞傷害1、図7、図8との密着性の寄与を研究するための生体模倣材料として使用されています。足場として使用されるポリマービーズは、色（例えば、青色蛍光赤、青、緑、オレンジ）の広い範囲で利用可能であるので、このアプローチを使用する利点の一つは、添付イベントの視覚化の容易さです。したがって、機能を妨げる可能性が直接タンパク質標識は、回避することができます。このように可溶性タンパク質と比較して、より生理学的に関連する立体構造を反映さらに、表面結合模倣細菌表面上の付着の多価ディスプレイを。 無傷の細菌やbacteriを用いた研究と比較するとらの変異体は、ビーズのアプローチは、細菌増殖に関連する問題を回避します。増殖培地および栄養枯渇の酸性化は、負の宿主細胞に影響を与え、細菌の複製は、最終的には妥協-例えば、無傷の細菌を用いて細胞をホストする細菌付着の長期（ 例えば、O / N）の研究は、多くの場合、細菌の増殖を伴う現象によって危険にさらされています結像品質。 より最近では、ビーズに結合したアドヘシンの使用は、細菌付着の下流のプロセスのシグナリングに関与する宿主細胞因子の親和性精製の ​​ためのツールとしてのそれらの使用を含むように拡張されている。V.腸炎 MAM7は、宿主細胞膜におけるホスファチジン酸への結合を介して、RhoAの活性化およびアクチン再配列1,3をトリガする 。MAM結合ビーズを精製し、MAM-宿主細胞の結果として組み立てシグナリングプラットフォームに関与するタンパク質を同定するために使用されています結合。ビーズができるので、簡単に短い遠心分離工程によって上清から分離され、そして目的のタンパク質を共有結合的に結合され、これは、夾雑タンパク質からの分離を達成するための優れた方法であり、そのようなプロテオミクスまたはウェスタンなどの下流の用途に使用することができ、関連するタンパク質複合体を、豊かブロッティング。

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td>Danger; corrosive 
			can be bought as solution or freshly prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PN22317</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30089</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&#160;&#956;m mean particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0280</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLB9</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26266</td>
			<td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Danger; corrosive and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose - With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&#160;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>for infection experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>for maintenance of cultured host cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin - 
			Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>MK401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoirs (25ml)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F267660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture facilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

V.腸炎付着MAM7は、ホスト表面受容体の認識に関与する7タンデム哺乳類細胞侵入（MCE）ドメインを含みます。我々は、精製されたフラグメントは、V.と競合するこれらの材料の能力を試験するために、すべての7タンデムMCEドメイン（MAM7）または最初MCEドメイン（MAM1）のいずれかを包含する、組換えに結合されたポリスチレンビーズを使用しました結合宿主細胞のための腸炎及び接着阻害剤としてのこれらの材料の結果として得られる効果。 HeLa細胞を感染させたV. in vitroでの感染から生じる腸炎株 POR1、および細胞傷害性は、4時間（ 図3）後に評価しました。 0.1％トリトンX-100（正の溶解制御）によるHela細胞の処理完全な細胞溶解をもたらし、非感染細胞は細胞毒性の非常に低いレベルを示した。 インビトロ POR1と未処理の細胞の感染は、細胞溶解の非常に高いレベルをもたらし、そしてこのMAM7 - コによって阻害されましたupledビーズではなくMAM1結合またはGST-結合された制御ビーズ（ 図3）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> 腸炎ビブリオの図3.キャラは競合アッセイの間、上皮細胞における細胞毒性を誘導した。細胞をVで処理しました異なる競合する事業体の存在下で示されるように- 腸炎 （VP）は、（+）で示されていない、または全く細菌（）（COMP）。これらには、COMPのどちらかが含まれていません。 （ - ）、MAM7ビーズ（MAM7）、MAM1ビーズ（MAM1）またはGSTコントロールビーズ（GST）。対照として、細胞をトリトンX-100（トリトン、溶解制御）のいずれかで処理した、または感染していない（uninf）に放置しました。 4時間後のLDH放出はセクション3で説明したように測定し、そして上記のように、結果は、トリトン対照（100％）とブランク（0％）に対して正規化しました。結果は、三連の実験からの平均±SEMで。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> Vの列挙MAM7-、MAM1-、またはGSTコントロールビーズとインキュベートした未処理のHeLa細胞、または細胞のいずれかに接続されている腸炎は 、MAM7ビーズことを明らかにしたが、MAM1-またはGST-制御ビーズは、Vを負かすありません細胞表面受容体（ 図4）をホストに取り付けるための腸炎 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> 競合実験中に細菌付着の図4キャラクタリゼーション。HeLa細胞を感染させたV. （ - ）非存在下における腸炎 POR2（VP +）、または競合実体の存在、以下のように（COMP。）：MAM7ビーズ（MAM7）、MAM1ビーズ（MAM1）またはGSTコントロールビーズ（GST）を。細菌付着のように、1時間後に測定しました<html>セクション3に記載した結果は、三連の実験からの平均±SEMで。手段（CFU / mlの中FLTR）が2.3010 6、1.5310 5、2.0510 6、2.1210 6です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> フルオロフォア標識されたビーズに結合されたアドヘシンは、宿主細胞への細菌の付着を模倣した （図5）は、細胞イメージングのための強力なツールである物質の生成につながります。 MAM7結合青色蛍光ビーズを使用して、我々は、上皮細胞にMAM7媒介添付ファイルのプロセスを特徴とします。宿主細胞に対するMAM7の結合は、F-アクチン（ 図5B）のために染色するためにローダミン-ファロイジンを用いた共可視化したストレスファイバーのアクチン再構成および形成されました。 _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; ヒーラにMAM7結合ビーズの図5の調製およびフルオロフォアの使用は青色蛍光バイオミメティックビーズの（A）サスペンション （右チューブ、10倍株式）。画像化目的のためにバイオミメティックビーズを標識し、コントロール（左チューブ）をバッファリングする。（B）アタッチメントアクチン再構成及びストレスファイバー形成の細胞をもたらします。 （ローダミン - ファロイジンで染色した赤、）青色蛍光ビーズの添付ファイルと結果のアクチンストレスファイバーは、顕微鏡によって画像化しました。バー、10μmです。パネルBの画像はリムら 1から適応し、クリエイティブコモンズのライセンスの下で再現された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

biomimetic-materials-to-characterize-bacteria-host-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.2K ビュー.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

ビデオ: Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

免疫・感染学

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌<em&gt;リステリア菌</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

形態変化を特徴付けるプロトコル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;抗生物質治療に対する反応

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...