軟骨インプラントは、軟骨マトリックスにおける組織のリモデリングを問い出す翻訳簡素なアクセス可能な方法を表す。この方法は、潜在的な新しい治療法が関節構造にどのような影響を与えるかについての早期の洞察を提供するかもしれない。この技術の主な利点は、軟骨がネイティブの3D環境に残り、バイオマーカーを使用して細胞と周囲のマトリックスとの相互作用のプロファイリングを可能にすることです。
この方法の原理は軟骨に特有のものではありません。排泄物は、オビウム、肝臓、肺などの他の組織から抽出し、マトリックス由来のバイオマーカーを使用して尋問することができる。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の卒業生であるアマリー・エングストロームです。
無菌環境で層流フードの外側の組織調達プロセス全体を実行します。地元の食肉処理場から、1.5歳から2歳までの子牛から新鮮な牛脛骨大腿骨膝関節全体を得る。次に、最初に余分な肉を取り除き、コンディレ、半月板、腱、滑膜を明らかにすることによって、ふくらはぎの膝を穏やかに解剖する。
腱と滑膜を切断し、関節をバラバラにします。半月板を取り除き、大腿骨の小間症を露呈する。3ミリメートルの生検パンチャーを使用して、大腿骨顆の負荷軸受面積から外植を分離し、可能な限り軟骨下骨に平行かつ近いメスで切断することによって、耳介表面から外植を放出する。
すぐに50ミリリットルチューブまたはペトリ皿に1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEM F12グルチマックス培地に外植を保存し、混合します。組織培養を開始するには、蒸発によって誘発される変動を最小限に抑えるために、各グループ内のすべての複製を斜めに配置する層流フードの滅菌96ウェルプレートに外植体を移す。上清の蒸発をさらに避けるために培養板の外側のウェルにPBSを加える。
次いで、培養培地またはPBSのいずれかで外植を3回洗浄する。5%の二酸化炭素を有する摂氏37度のインキュベーターで最大10週間の実験開始まで、ウェルあたり200マイクロリットルの培養培地で外植物を培養する。何らかの処理を施す場合は、培地を変える前に培地中で希釈することにより、外植油中の必要な濃度にこれらを調製する。
ラミナーフローフードで2~3日ごとに培養培地を交換します。各ウェルから上澄み地をそっと取り出し、新しい96ウェルプレートに移して保管します。すぐに各井戸に新鮮な培養培地または処理の200マイクロリットルを追加します。
培地の変化の間に外植を乾燥させず、すべての外植物が新しい媒体に完全に沈まっていることを確認してください。シーリングテープで新しいプレートをシールし、組織のターンオーバーとタンパク質発現のバイオマーカー分析のためにマイナス20°Cで保存します。再サズリン試験を開始するには、10%レサズリンを含有する培地の溶液を作る。
先に述べたように上清を収穫し、37°Cで10%の外植物を摂氏37度で、または上清が紫色になるまで浸漬する。次に、調整されたバックグラウンドコントロールのresazurin溶液を黒いマイクロタイタープレートに移し、540ナノメートルの励起と590ナノメートルの放出で蛍光を測定します。この後、外植を洗浄媒体に5〜10分間沈め、レサズリンが完全に拡散し、使用すれば新しい培養培地または治療を加えるようにします。
細胞生存率の間接的な測定として、週1回の代謝活性の測定を続ける。本研究では、ウシの完全な深さの外植は、単離、培養、および処理される。外植は治療のために4つのグループに分けられ、治療のために、オンコスタチンMおよび腫瘍壊死因子αで治療したもの、GM 6001でオンコスタチンMおよび腫瘍壊死因子αで治療したもの、インスリン増殖因子1で治療されたもの、および治療なしの対照を含む。
代謝活性は、4つのグループすべてについて3週間を通して比較的安定している。IGF-1が増加し、O+T基が対照と比較して減少する傾向があった。次に、OプラスTを週に3回培養井戸に適用し、OプラスT媒介軟骨の分解を調査する。
O plus Tは、7日目から21日目までの2種類のコラーゲン分解を増加させ、アグリカン分解を対照群と比較して3日目から14日目に増加させることが分かる。GM 6001をOプラスTと組み合わせて加えると、OとT媒介C2Mの放出がブロックされますが、10日目のO+T群と同様のレベルのAGN X1への影響は限定的です。成長因子1のようなインスリンは、同化刺激が軟骨ECMターンオーバーをどのようにモジュールするかを調査するために、牛の完全な深さの外植に毎週3回適用される。
IGF-1が軟骨外植に及ぼす影響は、主に2種類のコラーゲン形成の測定に対して、同化刺激に期待される。IGF-1で治療する場合、Pro-C2レベルは対照群で観察されたものよりも減少し、IGF-1が7日目から2種類のコラーゲン形成を刺激することを示す。外植は時間の経過とともに劣化する可能性があるため、異なるメディア交換ステップで外植物を失ったり破壊したりしないために、すべての処理および洗浄工程において慎重なピペット処理が重要です。
このモデルを使用して生成された結果は、単独で立つものではなく、ヒト組織および細胞および新しいモデルで生成されたデータによってサポートされ、発見をさらに検証する必要があります。結果だけでなく、組織の根底にあるメカニズムに光を当てるために、遺伝子やタンパク質発現解析、免疫組織化学、その他の永久的な分子生物学技術などの他の分子生物学技術を使用して、組織と上清の両方をさらに分析することが可能です。
