著者らは、この研究に資金を提供してくれた嚢胞性線維症財団に感謝したいと思います。

1.細菌分離物の収集
<ol><li>SickKids(トロント)で吸入トブラマイシンによる根絶治療を受けているCFの小児患者のコホートから 緑膿菌 分離株を入手します。分離株をクエン酸グリセロールで-80°Cで凍結し、使用前に少なくとも3回サブカルチャーします。</li>
</ol>2. in vitro バイオフィルム形成
注:改変を加えたin vitroバイオフィルム形成には、チャンバーカバーガラス法1を使用してください。このモデルの全体的なワークフローを図 1 に示します。
<ol><li>緑膿菌を分離した 緑膿菌 を、トリプシン性大豆寒天培地と5%羊の血液で調製した血液寒天培地で37°Cで一晩増殖させます( 材料の表を参照)。</li>
	<li>血液寒天培地から1〜2個の細菌コロニーを4mLの溶解ブロス(LB)に接種します。225rpmに設定したシェーカーで37°Cで一晩成長させます。</li>
	<li>4 mLの新鮮なLBに40 μLの培養物を加えて、一晩接種物の1:100希釈液を調製し、225 rpmに設定されたシェーカーで37°Cで3〜4時間増殖させ、600 nm(OD600)(初期対数期)で約0.1の光学密度を達成します。</li>
	<li>220μLの接種材料を8チャンバーカバーガラススライドの各ウェルに移します。邪魔されずに37°Cで24時間インキュベートします。</li>
	<li>バイオフィルムがベースで剥がれるのを防ぐために、各ウェルから培地をゆっくりと取り出します。 注意: スライドを45°の角度で前方に傾け、ピペットチップでベースに触れずに、各チャンバーウェルの下部の角から培地を吸引します。</li>
	<li>56 μg/mLの蛍光標識モノクローナル抗体(mAb)100 μLを調製し、指定のチャンバーウェルの側面にゆっくりと加えます。室温(RT)で1時間インキュベートし、細菌抗原エピトープに抗体が付着できるようにします。 注:使用前に、蛍光標識(赤)mAb Psl0096をLBで希釈して、最終濃度56 μg/mLを得てください。Psl0096は、抗Psl mAb(Cam003の最適化された親和性誘導体)であり、最初の細胞接着および構造的完全性に関与する 緑膿菌バイオ フィルムの主要なEPSマトリックス成分であるクラスI Pslエピトープに結合します15。</li>
	<li>1000 μg/mLの抗生物質溶液100 μL( 材料表を参照)を調製し、指定されたチャンバーウェルの側面にゆっくりと加えます。邪魔されずに37°Cで24時間インキュベートします。 注:使用前に、LBで50 mg / mLのトブラマイシン抗生物質を希釈して、最終濃度1000 μg / mLを得ます。.</li>
</ol>3. バイオフィルム蛍光染色
<ol><li>生細胞染色蛍光色素の0.01 mM溶液を調製します。チャンバー入りウェルから培地をゆっくりと取り出し、各ウェルに200 μLの染料混合物を加えます。RTで暗所で45分間インキュベートします。 注:使用前に、5 mMストック4 μLを2 mLのLBに加えて、生細胞染色(緑色)蛍光色素を調製します。</li>
	<li>各ウェルから培地をゆっくりと取り出し、200μLの新鮮なLBで2回洗浄します。</li>
	<li>各ウェルに200 μLの新鮮なLBを加え、共焦点顕微鏡による検査に進みます。</li>
</ol>4. 共焦点顕微鏡による画像取得
注: 画像処理と COMSTAT 分析の手順を 図 2 に示します。バイオフィルム染色の同日にウェルの画像を取得します。視覚化の遅延が1時間を超える場合は、チャンバー付きカバーガラスを暗闇で冷蔵し、さらに処理します。
<ol><li>共焦点顕微鏡システム( 材料の表を参照)を使用して、適切なレーザー励起波長と取得用のフィルターセットを使用してウェルの画像を取得します。 注:ここでは、蛍光標識(赤)mAbおよび生細胞(緑)染色剤を、それぞれ561 nmおよび491 nmの励起波長を使用して励起します。</li>
	<li>20〜25倍の水浸レンズを使用して、層状のzスタック画像(基層から各バイオフィルムセグメントの上部まで)を0.3μm刻みでキャプチャします。ウェルごとに少なくとも6つの画像スタックを取ります。 注:ここでは、25倍水浸レンズを備えた高解像度カメラを使用して画像を視覚化し、画像分析ソフトウェアを使用して処理します( 材料の表を参照)。ソフトウェアのセットアップとデジタルイメージングパラメータ(輝度と感度)は、1回の実験ですべての取得で一定に保ちます。</li>
	<li>COMSTAT解析のために画像をOME-TIFFとして保存します。 注意: OME-TIFFがチャネルごとに別々に保存されていることを確認してください(つまり、赤と緑)。この手順は、使用する画像解析ソフトウェアによって異なります。</li>
	<li>ステップ 2.1 から 4.3 を繰り返して、細菌分離株ごとに合計 3 つの生物学的複製 (つまり、3 つの独立した実験) から画像をキャプチャします。</li>
</ol>5. COMSTAT分析
注:ImageJのプラグイン(Comstat2)として書き換えられた、無料で入手可能なコンピュータプログラムCOMSTAT16,17を使用して、画像を定量的に分析します。ダウンロードしたパッケージ内のバイオフィルムの画像スタックを分析するための一般的な手順をお読みください。この寄稿は、バイオフィルム形成に対する抗菌剤の影響を定量化するために推奨される、選択されたImageJ処理ステップとCOMSTAT機能を含む、要約されたプロトコルを提供します。
<ol><li>http://www.comstat.dk/ から Comstat2 パッケージをダウンロードします。インストールされたフォルダ内で、ImageJを見つけて実行します。</li>
	<li>デスクトップ上にソースフォルダを作成し、そのフォルダに OME-TIFF を 1 つ追加します。</li>
	<li>ソースフォルダからOME-TIFFを開き、バイオマスを含まない空のレイヤーをすべて削除します。これらのレイヤーは、zスタックの最初または最後の数レイヤーになります。 注意: 顕微鏡で定義されたzスタック境界は、ユーザーによって過大評価されることがあります。これらの空のレイヤーを削除すると、COMSTAT 解析の Z スタック境界がより詳細に確立されます。</li>
	<li>ImageJ に OME-TIFF をインポートするには、[ ファイル] |インポート |画像シーケンス。ソースフォルダを見つけ、開かずに強調表示して、[ 選択]をクリックします。「シーケンスオプション」ウィンドウが表示されます。 [OK] を選択します。 注:ImageJに追加の画像をインポートするには、まずソースフォルダから以前のOME-TIFFを削除し、次に新しいOME-TIFFをフォルダに追加して、手順5.3と5.4を繰り返します。</li>
	<li>バイオフィルムの向きを反転するには、[ 画像] |トランスフォーム |[Z]を反転して、サブストラタムを最初(最上位)のスタックとして配置します。 注:COMSTATアルゴリズムは、上部(スタック1)から下部へのz方向のバイオフィルムを読み取ります。使用する共焦点顕微鏡システムによっては、OME-TIFF出力を反転させることができます。したがって、サブストラタムをイメージスタック1として配置することにより、スライスの順序を逆にして、出力データに欠陥が生じないようにすることが重要です。</li>
	<li>画像のプロパティを定義するには、[ 画像] |プロパティ。「ソース」ウィンドウが表示されます。<ol><li>「長さの単位」を「ミクロン」と指定します。</li>
		<li>次の式を使用して、「ピクセル幅」と「ピクセル高さ」を数学的に決定します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61759/61759equ01.jpg"> (1) ここで、「ピクセル幅」と「ピクセル高さ」は 0.427 と定義され、電荷結合デバイス (CCD) 上のピクセルの物理的な長さは 16 μm です。総倍率は25倍です。拡大鏡の位置は1.5倍です。 注:ピクセルあたりのセルサイズの計算に使用される式は、顕微鏡カメラの製造元によって異なる場合があります。または、「ピクセル幅」と「ピクセル高さ」は、空間キャリブレーションによって定義できます(https://imagej.net/Spatial_Calibration を参照)。</li>
		<li>「ボクセル深度」を 0.3 (つまり、各 Z スタック レイヤー間の増分スペース) として定義します。「ソース」ウィンドウで 「OK 」を選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>画像のしきい値を調整するには、[ Image |調整 |しきい値。「しきい値」ウィンドウが表示されます。 注:画像内のオブジェクトは、グレースケールの背景で赤く表示されます。あるいは、「Threshold」ウィンドウのドロップダウンメニューを使用して「Red」を「B&W」に変更することで、閾値を白黒で調整することもできます。<ol><li>画像ウィンドウで、スライダーを右端(つまり、バイオフィルムの最上層)に調整します。バックグラウンドノイズを除去するには、画像のヒストグラムを表示する「しきい値」ウィンドウを使用して、最大しきい値と最小しきい値を手動で設定します。まず、下のスライダーをできるだけ右に調整して、最大しきい値を設定します。次に、上のスライダーを使用して最小しきい値を調整し、画像を赤いバイオマスとグレースケールの背景の2つのフェーズに分割します(図3)。 注:本明細書に記載されている in vitro バイオフィルム形成および蛍光顕微鏡法は、理想的な場合にOME-TIFFを生成し、単純なヒストグラム閾値法によって画像を2つの異なるフェーズにセグメント化することを可能にする。ただし、場合によっては、異なるフェーズ間のヒストグラムの区別が明確でない場合があります。これは、広範なバックグラウンドノイズの存在、さまざまなバックグラウンド強度、またはバイオマスとバックグラウンド間の低強度のコントラストが原因である可能性があります。このような場合、ユーザは拡張セグメンテーション手順18、19を採用すべきである。<ol><li>または、「しきい値」ウィンドウで「デフォルト」として設定された左側のドロップダウンメニューを使用して、個々の画像のしきい値をアルゴリズムで調整します。この機能では、17 種類のアルゴリズムしきい値オプションから選択できます (https://imagej.net/Auto_Threshold を参照)。最も適切なオプションを選択し、[自動]を選択してしきい値を設定します。</li>
		</ol></li>
		<li>しきい値を調整したら、画像ウィンドウのスライダーを使用して各レイヤーをスクロールし、バックグラウンドノイズが全体的に十分に除去されていることを確認します。</li>
		<li>「しきい値」ウィンドウで 「設定 」を選択して、最初に下限しきい値を修正します。「Set Threshold Levels」ウィンドウが表示されます。 [OK] を選択します。もう一度 [設定 ] を選択し、この手順を繰り返して最大しきい値を修正します。 注意: 「設定」を選択するたびに、下のスライダーが自動的に調整される場合があります。このような場合は、スライダーを手動で再調整し(または、アルゴリズムのしきい値のいずれかを使用している場合は「自動」を選択)、手順5.6.2〜5.6.3を繰り返します。主な考え方は、スライダーが自動的に再調整されるたびに、上限と下限の両方のしきい値が固定されるように、後で「設定」を追加で2回選択する必要があるということです。</li>
		<li>[適用]を選択すると、[スタックをバイナリに変換]ウィンドウが表示されます。[OK] を選択し、[しきい値] ウィンドウを終了します。</li>
		<li>新しく調整したOME-TIFFを保存するには、[ プラグイン]|バイオフォーマット |バイオフォーマットエクスポーター|.新しいファイル名を入力し、ソースフォルダにOME-TIFFとして保存します。「Bio-Formats Exporter – Multiple Files」ウィンドウが表示されます。 [OK] を選択します。「Bio-Formats Exporter Options」ウィンドウが表示されます。 [OK] を選択します。 メモ: COMSTAT 解析に進む前に、新しく調整された白黒の OME-TIFF のみがソース フォルダに保存されていることを確認してください。フォルダから元のOME-TIFFをすべて削除します。</li>
	</ol></li>
	<li>COMSTATを実行するには、[ Plugins |comstat2 |.「バージョン情報」ウィンドウが表示されます。 [OK] を選択します。3つのウィンドウが表示されます。<ol><li>「監視ディレクトリ」ウィンドウ(右上)で、「 追加」を選択します。ソースフォルダを見つけ、開かずに強調表示して、[選択]を選択します。「Images in Directories」ウィンドウが表示されます(左上)COMSTATを介して分析するOME-TIFFが一覧表示されます。</li>
		<li>「Comstat 2.1」ウィンドウ(右下)で、「自動しきい値設定(Otsuの方法)」の選択を解除して、ソフトウェアが個々のOME-TIFFに対して以前に設定されたしきい値を使用するようにします。また、 Connected Volume Filtering(CVF)の選択を解除して、バイオフィルムの非常に薄い部分、およびバイオフィルム構造のボイド内に見られる自由浮遊細胞またはバイオマスが分析に含まれるようにします。 注:COMSTAT分析は、抗菌治療後の非常に初期のバイオフィルム(24時間の初期増殖)および残りのプランクトン細胞/コロニーに対して行われるため、ここではCVFの選択を解除します。成熟バイオフィルムの場合は、CVFを選択して、バイオフィルム構造に接続されたバイオマスのみが定量化されるようにします。</li>
		<li>「Comstat 2.1」ウィンドウ(右下)で、定量分析に必要な特徴を選択します。ここでは、[Bio Mass]、[Thickness Distribution]、[Surface Area] を選択します。[実行] を選択してプログラムを実行します。「ログ」ウィンドウ(左下)では、「選択した機能/画像で完了!」と表示されるまで、出力データが処理されている様子が表示されます。COMSTAT の測定値を記録します。これらの測定値は、ソースフォルダにTXTファイルとしても自動的に保存されます。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+infections:+community+structure,+antimicrobial+tolerance+and+immune+response.">Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response.</a> Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).</li><li>Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+diversity+of+environmental+GIM-1-producing+bacteria+collected+during+a+long-term+outbreak.">Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Powell, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+extracellular+polymeric+network+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+alginate+oligosaccharides.">Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. &. #. 2. 1. 6. ;., Wang, H., H&#248;iby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance,+respiratory+tract+infections+and+role+of+biofilms+in+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).</li><li>Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-Pseudomonas+aeruginosa+interactions+promote+biofilm+formation+and+antibiotic+resistance.">Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance.</a> Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).</li><li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+interaction+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+enhances+tobramycin+resistance.">Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).</li><li>Rojo-Molinero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+biofilms+with+aztreonam+and+tobramycin+is+a+novel+strategy+for+combating+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+respiratory+infections.">Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).</li><li>Hentzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function.">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).</li><li>Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+chambers.">Growing and analyzing biofilms in flow chambers.</a> Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).</li><li>Luo, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sensitive+thresholding+method+for+confocal+laser+scanning+microscope+image+stacks+of+microbial+biofilms.">A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms.</a> Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).</li><li>Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+effects+of+sputum+on+biofilm+development+using+a+chambered+coverglass+model.">Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54819 (2016).</li><li>DiGiandomenico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broadly+protective+human+antibodies+to+Pseudomonas+aeruginosa+exopolysaccharide+Psl+by+phenotypic+screening.">Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li><li>Vorregaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comstat2+-+a+modern+3D+image+analysis+environment+for+biofilms,+in+Informatics+and+Mathematical+Modelling.">Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling.</a> Technical University of Denmark. , (2008).</li><li>Hashemi, M. A., Khaddour, G., Fran&#231;ois, B., Massart, T. J., Salager, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tomographic+imagery+segmentation+methodology+for+three-phase+geomaterials+based+on+simultaneous+region+growing.">A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing.</a> Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).</li><li>Rogowska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+and+fundamentals+of+medical+image+segmentation.">Overview and fundamentals of medical image segmentation.</a> Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).</li><li>Webb, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+technician+effects+when+extracting+quantities+from+microscope+images.">Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images.</a> Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).</li><li>Xavier, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+threshold+selection+procedure+(OTS)+for+segmentation+of+scanning+laser+confocal+microscope+images.">Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images.</a> Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).</li><li>Arena, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+cell:+turning+images+into+numbers+with+ImageJ.">Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260 (2017).</li><li>Daims, H., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+uncultured+microorganisms+by+fluorescence+microscopy+and+digital+image+analysis.">Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).</li><li>Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+procedure+for+automatic+and+accurate+segmentation+of+volumetric+CLSM+biofilm+images.">A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images.</a> Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+biofilms+formed+by+nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).</li><li>Stapper, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+production+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development+and+architecture,+but+is+not+essential+for+biofilm+formation.">Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation.</a> Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).</li><li>Reichhardt, C., Parsek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+architecture+and+matrix+localization.">Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 677 (2019).</li><li>Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+biofilm+structure+using+image+analysis.">Quantifying biofilm structure using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).</li><li>Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biofilm+image+thresholding+methods.">Evaluation of biofilm image thresholding methods.</a> Water Research. 35, 1149-1158 (2001).</li><li>Ross, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+confocal+images+of+biofilms+grown+on+irregular+surfaces.">Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces.</a> Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+development+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix.">Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> PLoS Pathogens. 5, (2009).</li><li>Mah, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426, 306-310 (2003).</li><li>Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrients+determine+the+spatial+architecture+of+Paracoccus+sp.+biofilm.">Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm.</a> Biofouling. 26, 449-459 (2010).</li><li>Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenazines+affect+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+in+similar+ways+at+various+scales.">Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales.</a> Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).</li><li>Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa+conditional+psl+variants+reveals+roles+for+the+psl+polysaccharide+in+adhesion+and+maintaining+biofilm+structure+postattachment.">Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment.</a> Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).</li></ol>

in vitroバイオフィルム構造の3次元画像を定量的に比較するための規定された方法はなく、この文脈で説明される手順は、オペレーター間のばらつきのために標準化するのが難しいことがよくあります20。したがって、このプロトコルは、さまざまな抗菌条件下でのin vitroバイオフィルム構造の変化を定量化しようとするCOMSTATアプリケーションのためのシンプル?...

バイオフィルムは、自己生成した細胞外高分子物質(EPS)のマトリックスに配向した微生物の凝集体です。EPSマトリックスは非常に複雑で、主に細菌細胞、水、タンパク質、多糖類、脂質、核酸1で構成されており、これらすべてがバイオフィルムを自由生活のプランクトン細胞とは明らかに異なるものにしています。バイオフィルムEPSは、互いに接着し、さまざまな表面に付着します。EPSマトリックスは、代謝物、遺伝物質、および細胞間シグナル伝達と防御に使用される化合物の細胞間交換を媒介する特性を持っています2。これらの特性は、バイオフィルムの構造的完全性と外部ストレス要因からの保護を総合的に提供し、免疫回避と抗菌耐性に貢献します3。
緑膿菌は、よく知られている院内病原体であり、抗菌薬に応答して回避的なバイオフィルム成長戦略を採用することが知られています。この代表的な例は、劣性遺伝性疾患である嚢胞性線維症(CF)の患者に発生します。バイオフィルムは、抗菌薬耐性緑膿菌4の発症に極めて重要な役割を果たし、CF患者の慢性肺感染症の確立を可能にし、肺機能の低下と早期死亡の加速を引き起こします5。したがって、in vitro バイオフィルム研究は、CF 6,7 患者から得られた緑膿菌分離株に対する抗生物質および新しい抗感染剤の有効性をテストするために実施されます。バイオフィルム形成後、抗菌剤を構造の外部に塗布し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を使用して、バイオフィルムセグメントの高解像度の3次元再構成を生成します。その後、コンピュータソフトウェアであるCOMSTATをImageJのプラグインとして使用して、バイオフィルムアーキテクチャ8,9,10,11の変化を定量化するのが一般的な方法です。
COMSTATはバイオフィルム構造の定量化には有用ですが、画像解析の再現性と標準化についてはあまり注目されていません。例えば、COMSTAT を実行する前に実行されるイメージ処理プロシージャーは客観的ですが、イメージしきい値12,13 を設定する際には主観的な要素を含んでいます。同様に、COMSTATプログラムでは、オペレーターは画像セグメンテーションの基本条件から高度な条件、パラメータ、および10の定量分析機能(厚さ分布、表面積、バイオマス、無次元粗さ係数など)を選択できます。多数のユーザーオプションとさまざまなオペレーターの専門知識レベルが組み合わさると、バイオフィルムの動作に関する誤った報告につながる可能性があります。
したがって、このプロトコルの目標は、COMSTATを使用してin vitroバイオフィルム構造を定量的に比較するための比較的簡単な方法を提示することです。ここでは、CF P. aeruginosa分離株からのバイオフィルムセグメントの3次元画像を、再現性のあるin vitroバイオフィルム実験を行うために使用される確立された技術であるチャンバーカバーガラスモデル14を使用してCLSMを介してキャプチャします。この手法は、COMSTATをImageJのプラグインとして利用することで、研究者はさまざまな条件下で抗菌剤の存在下でのバイオフィルム構造の変化を定量的に特定することができます。全体として、この方法は、COMSTATの手動操作に関連する主観的なばらつきを排除することを目的としており、それによってセンター間でのプロトコルの標準化を促進します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Psl mAb, Psl0096</td>
			<td>Medimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>LBL666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin, 900 &#181;g/mg</td>
			<td>Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J66040</td>
			<td>It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum Volocity 6.3</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the effects of antimicrobials on in vitro biofilm architecture using comstat software

バイオフィルムは、細胞外高分子物質の自己生成マトリックスに依存して保護と構造的完全性を確保する微生物の集合体です。院内病原体である 緑膿菌は、 バイオフィルムの成長様式を採用し、嚢胞性線維症(CF)患者に慢性肺感染症を引き起こすことが知られています。コンピュータプログラムであるCOMSTATは、3次元共焦点画像からデータを抽出することにより、 緑膿菌の バイオフィルム構造における抗菌薬による変化を定量化するための有用なツールです。しかし、ソフトウェアの標準化された操作はあまり一般的ではなく、バイオフィルムの挙動を最適に報告し、中心を越えた比較を行うためには重要です。したがって、このプロトコルの目的は、COMSTATを介してさまざまな抗菌条件下で in vitro バイオフィルム構造を定量化するためのシンプルで再現性のあるフレームワークを提供することです。この手法は、CF P. aeruginosa 分離株を使用してモデル化され、バイオフィルム複製の形で成長させ、トブラマイシンと抗 Psl モノクローナル抗体 Psl0096 に曝露されます。この段階的なアプローチは、ユーザーの曖昧さを減らし、重要な画像処理ステップを見落とす可能性を最小限に抑えることを目的としています。具体的には、このプロトコルは、画像のセグメンテーションや適切な定量分析機能の選択など、COMSTATの手動操作に関連する主観的な変動の排除を強調しています。この方法では、COMSTATを実行する前に共焦点画像の処理に余分な時間を費やす必要がありますが、自動出力で誤って表現されたバイオフィルムの不均一性を最小限に抑えるのに役立ちます。

CFに感染した患者から培養した 緑膿菌分離 株を用いて、 in vitro バイオフィルム構造における抗菌薬による変化を正確に定量化するこのアプローチの強みを実証します。このモデルの全体的なワークフローを 図 1 に示します。ImageJ での画像処理と COMSTAT 分析の手順を図 2 に示します。図 3 に、CLSM z スタック画?...

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Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

緑膿菌のバイオフィルム構造に対する抗菌薬による変化は、嚢胞性線維症および慢性肺感染症の患者から培養された臨床分離株によって異なります。共焦点顕微鏡法に続いて、COMSTATソフトウェアを使用して、個々の分離株のバイオフィルム構造(表面積、厚さ、バイオマスなど)の変動を定量化し、抗感染剤の有効性を評価できます。

COMSTATソフトウェアを使用した In vitro バイオフィルムアーキテクチャに対する抗菌剤の影響の定量化

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

quantifying-effects-antimicrobials-on-vitro-biofilm-architecture

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

3.1K ビュー.  Hospital for Sick Children. 緑膿菌のバイオフィルム構造に対する抗菌薬による変化は、嚢胞性線維症および慢性肺感染症の患者から培養された臨床分離株によって異なります。共焦点顕微鏡法に続いて、COMSTATソフトウェアを使用して、個々の分離株のバイオフィルム構造(表面積、厚さ、バイオマスなど)の変動を定量化し、抗感染剤の有効性を評価できます。

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In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

免疫・感染学

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10における粒子結合のBet V 1アレルゲンのフローサイトメトリー分析

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

細胞毒性の評価と肺癌精密カット スライスで物質の免疫調節効果

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are needed to decipher the utilization of microbiome modulators for human health benefits. However, the large-scale screening and optimization of modulators to validate microbiome modulation and predict related health benefits may be practically difficult due to the need for large number of animals and/or human subjects. To this end, in vitro or ex vivo models can facilitate preliminary screening of microbiome modulators. Herein, it is optimized and demonstrated an ex vivo fecal microbiota culture system that can be used for examining the effects of various interventions of gut microbiome modulators including probiotics, prebiotics and other food ingredients, aside from nutraceuticals and drugs, on the diversity and composition of the human gut microbiota. Inulin, one of the most widely studied prebiotic compounds and microbiome modulators, is used as an example here to examine its effect on the healthy fecal microbiota composition and its metabolic activities, such as fecal pH and the fecal levels of organic acids including lactate and short-chain fatty acids (SCFAs). The protocol may be useful for studies aimed at estimating the effects of different interventions of modulators on fecal microbiota profiles and at predicting their health impacts.

This protocol describes an in vitro batch-culture fermentation system of human fecal microbiota, using inulin (a well-known prebiotic and one of the most widely studied microbiota modulators) to demonstrate the use of this system in estimating effects of specific interventions on fecal microbiota composition and metabolic activities.

ヒトの胎児微生物叢に対する介入レジメンの影響を推定するインビトロバッチ培養モデル

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...