Yazarlar, bu araştırma için fon sağladığı için Kistik Fibrozis Vakfı'na teşekkür eder.

1. Bakteriyel izolat toplama
<ol><li>SickKids'te (Toronto) inhale tobramisin ile eradikasyon tedavisi gören KF'li pediatrik hastalardan oluşan bir kohorttan P. aeruginosa izolatları elde edin. İzolatları kullanımdan önce en az üç kez -80 ° C'de gliserol sitrat ve alt kültürde dondurun.</li>
</ol>2. İn vitro biyofilm oluşumu
NOT: Modifikasyonlarla in vitro biyofilm oluşumu için odacıklı bir kapak camı yöntemi1 kullanın. Bu modelin genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.
<ol><li>P. aeruginosa'yı triptik soya agar ve% 5 koyun kanı ile hazırlanan kan agar üzerinde 37 ° C'de gece boyunca izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Kanlı agardan 1-2 bakteri kolonisini 4 mL lizojeni et suyuna (LB) aşılayın. 225 rpm'ye ayarlanmış bir çalkalayıcıda 37 °C'de gece boyunca büyütün.</li>
	<li>4 mL taze LB içinde 40 μL kültür ekleyerek 1:100 oranında bir gece boyunca inokülum seyreltmesi hazırlayın. 600 nm'de (OD600) (erken günlük faz) yaklaşık 0,1'lik bir optik yoğunluk elde etmek için 225 rpm'ye ayarlanmış bir çalkalayıcıda 37 ° C'de 3-4 saat büyütün.</li>
	<li>220 μL aşılamayı 8 odacıklı bir kapak camı slaytının her bir oyuğuna aktarın. 37 ° C'de 24 saat boyunca rahatsız edilmeden inkübe edin.</li>
	<li>Biyofilmlerin tabanda ayrılmasını önlemek için ortamı her bir kuyucuktan yavaşça çıkarın. NOT: Sürgüyü 45°'lik bir açıyla öne doğru eğin ve pipet ucuyla tabana dokunmadan ortamı her odacıklı kuyunun alt köşelerinden aspire edin.</li>
	<li>100 μL 56 μg/mL floresan etiketli monoklonal antikor (mAb) hazırlayın ve yavaşça ekleyin. Bakteriyel antijen epitopuna antikor bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce, 56 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için floresan etiketli (kırmızı) mAb, Psl0096'yı LB cinsinden seyreltin. Psl0096, ilk hücre bağlanması ve yapısal bütünlükte yer alan P . aeruginosa biyofilmlerinin önemli bir EPS matris bileşeni olan sınıf I Psl epitopuna bağlanan bir anti-Psl mAb'dir (Cam003'ün optimize edilmiş afinite türevi)15.</li>
	<li>100 μL 1000 μg / mL antibiyotik çözeltisi hazırlayın ve yavaşça ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) belirtilen odacıklı kuyucukların yan tarafına. 37 ° C'de 24 saat boyunca rahatsız edilmeden inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce, 1000 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için LB'de 50 mg / mL tobramisin antibiyotik stoğunu seyreltin.</li>
</ol>3. Biyofilm floresan boyama
<ol><li>Canlı hücre boyama floresan boyanın 0.01 mM'lik bir çözeltisini hazırlayın. Ortamı odacıklı oyuklardan yavaşça çıkarın ve her bir oyuğa 200 μL boya karışımı ekleyin. Karanlıkta RT'de 45 dakika inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce, 2 mL LB'ye 4 μL 5 mM stok ekleyerek canlı hücre boyama (yeşil) floresan boyayı hazırlayın.</li>
	<li>Ortamı her kuyucuktan yavaşça çıkarın ve 2x'i 200 μL taze LB ile yıkayın.</li>
	<li>Her kuyucuğa 200 μL taze LB ekleyin ve konfokal mikroskopi ile incelemeye devam edin.</li>
</ol>4. Konfokal mikroskopi ile görüntü elde etme
NOT: Görüntü işleme ve COMSTAT analiz prosedürü Şekil 2'de sunulmuştur. Biyofilm boyamanın aynı gününde kuyuların görüntülerini elde edin. Görselleştirmedeki gecikme 1 saati aşarsa, odacıklı kapak camını daha fazla işleme kadar karanlıkta soğutun.
<ol><li>Uygun lazer uyarma dalga boylarına ve elde etmek için filtre setlerine sahip bir konfokal mikroskop sistemi ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak kuyuların görüntülerini elde edin. NOT: Burada, sırasıyla 561 ve 491 nm uyarma dalga boylarını kullanarak floresan etiketli (kırmızı) mAb ve canlı hücre (yeşil) boyasını uyarın.</li>
	<li>20-25x suya daldırmalı lens ile 0,3 μm'lik artışlarla katmanlı z yığını görüntüleri (alt tabakadan her bir biyofilm segmentinin tepesine kadar) yakalayın. Kuyu başına en az 6 görüntü yığını alın. NOT: Burada, görüntüleri 25x suya daldırma lensli yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanarak görselleştirin ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak işlenin (bkz. Malzeme Tablosu). Tek bir deneydeki tüm alımlar için yazılım kurulumunu ve dijital görüntüleme parametrelerini (yani parlaklık ve hassasiyet) sabit tutun.</li>
	<li>COMSTAT analizi için görüntüleri OME-TIFF olarak kaydedin. NOT: OME-TIFF'lerin her kanal için ayrı ayrı kaydedildiğinden emin olun (yani kırmızı ve yeşil). Bu adım, kullanılan görüntü analiz yazılımına bağlı olarak değişir.</li>
	<li>Bakteri izolatı başına toplam 3 biyolojik kopyadan (yani 3 bağımsız deney) görüntü yakalamak için 2.1–4.3 adımlarını tekrarlayın.</li>
</ol>5. COMSTAT analizi
NOT: ImageJ'ye bir eklenti (Comstat16,17) olarak yeniden yazılmış, ücretsiz olarak kullanılabilen bilgisayar programı COMSTAT 2'yi kullanarak görüntüleri nicel olarak analiz edin. İndirilen paketteki biyofilmlerin görüntü yığınlarını analiz etmek için genel talimatları okuyun. Bu katkı, antimikrobiyallerin biyofilm oluşumu üzerindeki etkilerini ölçmek için önerilen seçilmiş ImageJ işleme adımları ve COMSTAT özellikleri ile özetlenmiş bir protokol sağlar.
<ol><li>Comstat2 paketini http://www.comstat.dk/'dan indirin. Yüklü klasörün içinde ImageJ'yi bulun ve çalıştırın.</li>
	<li>Masaüstünde bir kaynak klasör oluşturun ve klasöre tek bir OME-TIFF ekleyin.</li>
	<li>Kaynak klasörden OME-TIFF'i açın ve biyokütle içermeyen boş katmanları silin. Bu katmanlar, z-yığınının ilk veya son birkaç katmanı olacaktır. NOT: Mikroskop tanımlı z-yığını sınırları bazen kullanıcılar tarafından fazla tahmin edilir. Bu boş katmanları silmek, COMSTAT analizi için daha rafine bir z-yığını sınırı oluşturur.</li>
	<li>Dosya | İthalat | Görüntü Sırası. Kaynak klasörü bulun, açmadan vurgulayın ve Seç'e tıklayın. Bir 'Sıra Seçenekleri' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. NOT: ImageJ'de ek görüntüleri içe aktarmak için önce önceki OME-TIFF'i kaynak klasörden kaldırın, ardından yeni OME-TIFF'i klasöre ekleyin ve 5.3 ve 5.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Görüntü | öğesini seçerek biyofilmin yönünü çevirin Dönüştür | Alt tabakayı ilk (en üst) yığın olarak konumlandırmak için Z'yi çevirin. NOT: COMSTAT algoritmaları, biyofilmleri z yönünde yukarıdan (yığın 1) aşağıya doğru okur. Kullanılan konfokal mikroskop sistemine bağlı olarak, OME-TIFF çıkışı ters çevrilebilir. Bu nedenle, çıktı verilerinin kusurlu hale gelmesini önlemek için alt tabakayı görüntü yığını 1 olarak konumlandırarak dilimlerin sırasını tersine çevirmek önemlidir.</li>
	<li>Görüntü | Özellikleri. Bir 'Kaynak' penceresi görünecektir.<ol><li>'Uzunluk Birimi'ni 'mikron' olarak belirtin.</li>
		<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak 'Piksel genişliği' ve 'Piksel yüksekliği'ni matematiksel olarak belirleyin: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61759/61759equ01.jpg"> (1) Burada, 'Piksel genişliği' ve 'Piksel yüksekliği' 0,427 olarak tanımlanır, burada şarj bağlantılı cihazdaki (CCD) bir pikselin fiziksel uzunluğu 16 μm'dir; toplam büyütme 25x'tir; ve büyüteç konumu 1.5x'tir. NOT: Piksel başına hücre boyutunu hesaplamak için kullanılan denklem, mikroskop kamera üreticisine bağlı olarak değişebilir. Alternatif olarak, 'Piksel genişliği' ve 'Piksel yüksekliği' uzamsal kalibrasyon ile tanımlanabilir (https://imagej.net/Spatial_Calibration bakın).</li>
		<li>'Voksel derinliğini' 0,3 olarak tanımlayın (yani, her z-yığını katmanı arasındaki artımlı boşluk). 'Kaynak' penceresinde Tamam'ı seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntü | öğesini seçerek görüntü eşiğini ayarlayın Ayarla | Eşik. Bir 'Eşik' penceresi görünecektir. NOT: Görüntüdeki nesneler gri tonlamalı bir arka planla kırmızı görünecektir. Alternatif olarak, 'Kırmızı'yı 'S&B' olarak değiştirmek için 'Eşik' penceresindeki açılır menüyü kullanarak eşik siyah beyaz olarak ayarlanabilir.<ol><li>Görüntü penceresinde, kaydırıcıyı en sağa ayarlayın (yani, biyofilmin en üst katmanı). Arka plan gürültüsünü gidermek için, maksimum ve minimum eşik değerlerini manuel olarak ayarlamak için görüntünün histogramını görüntüleyen 'Eşik' penceresini kullanın. İlk olarak, alt kaydırıcıyı mümkün olduğunca sağa ayarlayarak maksimum eşik değerini ayarlayın. İkinci olarak, görüntüyü iki ayrı faza ayıran minimum eşik değerini ayarlamak için üst kaydırıcıyı kullanın: kırmızı biyokütle ve gri tonlamalı arka plan (Şekil 3). NOT: Burada açıklanan in vitro biyofilm oluşumu ve floresan mikroskopi prosedürü, ideal durumda OME-TIFF'ler oluşturur ve görüntülerin basit bir histogram eşik yöntemi aracılığıyla iki ayrı faza bölünmesine izin verir. Bununla birlikte, bazı durumlarda, farklı fazlar arasındaki histogram ayrımı o kadar net değildir. Bunun nedeni, yoğun arka plan gürültüsünün varlığı, değişen arka plan yoğunlukları veya biyokütle ile arka plan arasındaki düşük yoğunluklu kontrast olabilir. Bu gibi durumlarda, kullanıcılar gelişmiş bir segmentasyon prosedürübenimsemelidir 18,19.<ol><li>Alternatif olarak, 'Eşik' penceresinde 'Varsayılan' olarak ayarlanan sol açılır menüyü kullanarak tek tek görüntüler için eşikleri algoritmik olarak ayarlayın. Bu özellik, aralarından seçim yapabileceğiniz 17 farklı algoritmik eşik seçeneği sunar (https://imagej.net/Auto_Threshold bakın). En uygun seçeneği seçin, ardından eşiği ayarlamak için 'Otomatik'i seçin.</li>
		</ol></li>
		<li>Eşik değerleri ayarlandığında, arka plan gürültüsünün baştan sona yeterince giderildiğinden emin olmak için her katmanda gezinmek için görüntü penceresindeki kaydırıcıyı kullanın.</li>
		<li>Önce alt eşik değerini düzeltmek için 'Eşik' penceresinde Ayarla'yı seçin. Bir 'Eşik Düzeylerini Ayarla' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. Yeniden Ayarla'yı seçin ve maksimum eşik değerini sabitlemek için bu adımı tekrarlayın. NOT: Her 'Ayarla' seçildiğinde, alt kaydırıcı otomatik olarak ayarlanabilir. Bu gibi durumlarda, kaydırıcıyı manuel olarak yeniden ayarlayın (veya algoritmik eşiklerden birini kullanıyorsanız 'Otomatik'i seçin) ve 5.6.2–5.6.3 adımlarını tekrarlayın. Ana fikir, kaydırıcılar otomatik olarak yeniden ayarlandığında, hem üst hem de alt eşiklerin sabitlendiğinden emin olmak için 'Ayarla'nın daha sonra iki kez daha seçilmesi gerektiğidir.</li>
		<li>Uygula'yı seçin ve 'Yığını İkiliye Dönüştür' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin ve ardından 'Eşik' penceresinden çıkın.</li>
		<li>Eklentiler | Biyo-Formatlar | Biyo-Format İhracatçısı|. Yeni bir dosya adı girin ve kaynak klasöre OME-TIFF olarak kaydedin. Bir 'Biyo-Format Dışa Aktarıcı - Birden Çok Dosya' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. Bir 'Biyo-Format Dışa Aktarıcı Seçenekleri' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. NOT: COMSTAT analizine geçmeden önce kaynak klasöre yalnızca yeni ayarlanan siyah beyaz OME-TIFF'lerin kaydedildiğinden emin olun. Tüm orijinal OME-TIFF'leri klasörden kaldırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Eklentiler | Comstat2 |. Bir 'Hakkında' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. Üç pencere görünecektir.<ol><li>'Gözlemlenen Dizinler' penceresinde (sağ üstte), Ekle'yi seçin. Kaynak klasörü bulun, açmadan vurgulayın ve Seç'i seçin. COMSTAT aracılığıyla analiz edilecek OME-TIFF'leri listeleyen bir 'Dizinlerdeki Görüntüler' penceresi (sol üstte) görünecektir.</li>
		<li>'Comstat 2.1' penceresinde (sağ altta), yazılımın daha önce ayrı OME-TIFF'ler için ayarlanmış eşik değerlerini kullandığından emin olmak için 'Otomatik eşikleme (Otsu yöntemi)' seçimini kaldırın. Ayrıca, biyofilm yapısının boşluklarında bulunan serbest yüzen hücrelerin veya biyokütlenin çok ince kısımlarının analize dahil edildiğinden emin olmak için Bağlı Hacim Filtresig (CVF) seçimini kaldırın. NOT: Burada, CVF'nin seçimini kaldırın çünkü COMSTAT analizi çok erken biyofilmler (24 saatlik başlangıç büyümesi) ve antimikrobiyal tedaviden sonra kalan planktonik hücreler/koloniler üzerinde gerçekleştirilir. Olgun biyofilmler için, yalnızca biyofilm yapısına bağlı biyokütlenin miktarının ölçülmesini sağlamak için CVF'yi seçin.</li>
		<li>'Comstat 2.1' penceresinde (sağ altta), kantitatif analiz için istediğiniz özellikleri seçin. Burada Biyo Kütle, Kalınlık Dağılımı ve Yüzey Alanı'nı seçin. Programı çalıştırmak için Git'i seçin. 'Günlük' penceresinde (sol altta), çıktı verileri 'Seçilen işlevler/görüntüler ile tamamlandı!' görünene kadar işlenirken gösterilir. COMSTAT ölçümlerini kaydedin. Bu ölçümler ayrıca otomatik olarak kaynak klasörüne TXT dosyaları olarak kaydedilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+infections:+community+structure,+antimicrobial+tolerance+and+immune+response.">Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response.</a> Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).</li><li>Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+diversity+of+environmental+GIM-1-producing+bacteria+collected+during+a+long-term+outbreak.">Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Powell, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+extracellular+polymeric+network+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+alginate+oligosaccharides.">Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. &. #. 2. 1. 6. ;., Wang, H., H&#248;iby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance,+respiratory+tract+infections+and+role+of+biofilms+in+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).</li><li>Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-Pseudomonas+aeruginosa+interactions+promote+biofilm+formation+and+antibiotic+resistance.">Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance.</a> Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).</li><li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+interaction+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+enhances+tobramycin+resistance.">Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).</li><li>Rojo-Molinero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+biofilms+with+aztreonam+and+tobramycin+is+a+novel+strategy+for+combating+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+respiratory+infections.">Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).</li><li>Hentzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function.">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).</li><li>Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+chambers.">Growing and analyzing biofilms in flow chambers.</a> Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).</li><li>Luo, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sensitive+thresholding+method+for+confocal+laser+scanning+microscope+image+stacks+of+microbial+biofilms.">A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms.</a> Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).</li><li>Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+effects+of+sputum+on+biofilm+development+using+a+chambered+coverglass+model.">Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54819 (2016).</li><li>DiGiandomenico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broadly+protective+human+antibodies+to+Pseudomonas+aeruginosa+exopolysaccharide+Psl+by+phenotypic+screening.">Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li><li>Vorregaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comstat2+-+a+modern+3D+image+analysis+environment+for+biofilms,+in+Informatics+and+Mathematical+Modelling.">Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling.</a> Technical University of Denmark. , (2008).</li><li>Hashemi, M. A., Khaddour, G., Fran&#231;ois, B., Massart, T. J., Salager, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tomographic+imagery+segmentation+methodology+for+three-phase+geomaterials+based+on+simultaneous+region+growing.">A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing.</a> Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).</li><li>Rogowska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+and+fundamentals+of+medical+image+segmentation.">Overview and fundamentals of medical image segmentation.</a> Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).</li><li>Webb, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+technician+effects+when+extracting+quantities+from+microscope+images.">Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images.</a> Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).</li><li>Xavier, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+threshold+selection+procedure+(OTS)+for+segmentation+of+scanning+laser+confocal+microscope+images.">Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images.</a> Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).</li><li>Arena, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+cell:+turning+images+into+numbers+with+ImageJ.">Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260 (2017).</li><li>Daims, H., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+uncultured+microorganisms+by+fluorescence+microscopy+and+digital+image+analysis.">Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).</li><li>Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+procedure+for+automatic+and+accurate+segmentation+of+volumetric+CLSM+biofilm+images.">A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images.</a> Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+biofilms+formed+by+nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).</li><li>Stapper, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+production+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development+and+architecture,+but+is+not+essential+for+biofilm+formation.">Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation.</a> Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).</li><li>Reichhardt, C., Parsek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+architecture+and+matrix+localization.">Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 677 (2019).</li><li>Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+biofilm+structure+using+image+analysis.">Quantifying biofilm structure using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).</li><li>Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biofilm+image+thresholding+methods.">Evaluation of biofilm image thresholding methods.</a> Water Research. 35, 1149-1158 (2001).</li><li>Ross, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+confocal+images+of+biofilms+grown+on+irregular+surfaces.">Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces.</a> Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+development+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix.">Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> PLoS Pathogens. 5, (2009).</li><li>Mah, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426, 306-310 (2003).</li><li>Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrients+determine+the+spatial+architecture+of+Paracoccus+sp.+biofilm.">Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm.</a> Biofouling. 26, 449-459 (2010).</li><li>Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenazines+affect+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+in+similar+ways+at+various+scales.">Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales.</a> Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).</li><li>Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa+conditional+psl+variants+reveals+roles+for+the+psl+polysaccharide+in+adhesion+and+maintaining+biofilm+structure+postattachment.">Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment.</a> Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).</li></ol>

İn vitro biyofilm yapılarının üç boyutlu görüntülerini kantitatif olarak karşılaştırmak için önceden belirlenmiş bir yöntem yoktur ve bu bağlamda açıklanan prosedürlerin, operatörler arası değişkenlik nedeniyle standartlaştırılması genellikle zordur20. Bu nedenle, bu protokol, değişen antimikrobiyal koşullar altında in vitro biyofilm mimarisindeki değişiklikleri ölçmek isteyen COMSTAT uygulamaları için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve ...

Biyofilmler, kendi kendine üretilen hücre dışı polimerik maddelerden (EPS) oluşan bir matrise yönlendirilmiş mikroorganizma kümeleridir. EPS matrisi çok karmaşıktır, esas olarak bakteri hücreleri, su, proteinler, polisakkaritler, lipitler ve nükleik asitlerden1 oluşur ve bunların tümü biyofilmleri serbest yaşayan planktonik hücrelerden belirgin şekilde farklı kılar. Biyofilm EPS birbirine ve çeşitli yüzeylere yapışır. EPS matrisi, hücreler arası sinyalleşme ve savunma2 için kullanılan metabolitlerin, genetik materyalin ve bileşiklerin hücreden hücreye değişimine aracılık eden özelliklere sahiptir. Bu özellikler toplu olarak biyofilmlerin yapısal bütünlüğü ve dış stres faktörlerine karşı koruma sağlayarak bağışıklıktan kaçınmaya ve antimikrobiyal dirence katkıda bulunur3.
Pseudomonas aeruginosa, antimikrobiyallere yanıt olarak kaçış amaçlı bir biyofilm büyüme stratejisi benimsediği bilinen, iyi bilinen bir nozokomiyal patojendir. Bunun en iyi örneği, resesif genetik bozukluk olan kistik fibroz (KF) olan hastalarda görülür. Biyofilmler, antimikrobiyal dirençli P. aeruginosa4'ün gelişiminde çok önemli bir rol oynar ve KF'li hastalarda kronik akciğer enfeksiyonunun oluşmasına izin vererek akciğer fonksiyonlarında hızlı düşüşe ve erken mortaliteyeneden olur 5. Bu nedenle, CF 6,7 olan hastalardan elde edilen P. aeruginosa izolatlarına karşı antibiyotiklerin ve yeni anti-enfektif ajanların etkinliğini test etmek için in vitro biyofilm çalışmaları yapılmaktadır. Biyofilm oluşumunu takiben, antimikrobiyaller yapıya dışarıdan uygulanır ve biyofilm segmentlerinin yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu rekonstrüksiyonlarını oluşturmak için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılır. Daha sonra, biyofilm mimarisindeki değişiklikleri ölçmek için ImageJ'ye bir eklenti olarak bilgisayar yazılımıCOMSTAT'ı kullanmak yaygın bir uygulamadır 8,9,10,11.
COMSTAT, biyofilm yapısını ölçmek için yararlı olsa da, görüntü analizinin tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu daha az yaygın olarak ele alınmaktadır. Örneğin, COMSTAT çalıştırılmadan önce gerçekleştirilen görüntü işleme prosedürü nesneldir, ancak görüntü eşikleri12,13 ayarlanırken bir öznellik öğesi içerir. Benzer şekilde, COMSTAT programı, operatörün görüntü segmentasyonu için temel koşullardan gelişmiş koşullara ve parametrelere ve ayrıca on nicel analiz fonksiyonuna (örneğin, kalınlık dağılımı, yüzey alanı, biyokütle, boyutsuz pürüzlülük katsayısı) seçim yapmasına olanak tanır. Değişen operatör uzmanlık seviyeleriyle birleşen çok sayıda kullanıcı seçeneği, biyofilm davranışının yanlış yönlendirilmiş raporlanmasına neden olabilir.
Bu nedenle, bu protokolün amacı, COMSTAT kullanılarak in vitro biyofilm yapılarının kantitatif karşılaştırması için nispeten basit bir yöntem sunmaktır. Burada, bir CF P. aeruginosa izolatından alınan biyofilm segmentlerinin üç boyutlu görüntüleri, tekrarlanabilir in vitro biyofilm deneyleri gerçekleştirmek için kullanılan yerleşik bir teknik olan odacıklı kapak camı modeli14 kullanılarak CLSM aracılığıyla yakalanır. COMSTAT'ı ImageJ'e bir eklenti olarak kullanan bu yöntem, araştırmacıların değişen koşullar altında antimikrobiyallerin varlığında biyofilm mimarisindeki değişiklikleri nicel olarak tanımlamasına olanak tanır. Genel olarak, bu yöntem, COMSTAT'ın manuel olarak çalıştırılmasıyla ilişkili öznel varyasyonları ortadan kaldırmayı ve böylece protokollerin merkezler arasında standardizasyonunu kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Anti-Psl mAb, Psl0096</td><td>Medimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01200</td><td></td></tr><tr><td>Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized</td><td>BioShop Canada</td><td>LBL666</td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin, 900 &amp;micro;g/mg</td><td>Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific</td><td>J66040</td><td>It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency</td></tr><tr><td>Quorum Volocity 6.3</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td>Image analysis software</td></tr></tbody></table>

quantifying the effects of antimicrobials on in vitro biofilm architecture using comstat software

Biyofilmler, koruma ve yapısal bütünlük için kendi ürettiği hücre dışı polimerik madde matrisine dayanan mikroorganizma kümeleridir. Nozokomiyal patojen Pseudomonas aeruginosa'nın , kistik fibrozisli (KF) hastalarda kronik akciğer enfeksiyonuna neden olan bir biyofilm büyüme modunu benimsediği bilinmektedir. Bilgisayar programı, COMSTAT, üç boyutlu konfokal görüntülerden veri çıkararak P. aeruginosa biyofilm mimarisindeki antimikrobiyal kaynaklı değişiklikleri ölçmek için yararlı bir araçtır. Bununla birlikte, yazılımın standartlaştırılmış çalışması daha az yaygın olarak ele alınır, bu da biyofilm davranışının en iyi şekilde raporlanması ve merkezler arası karşılaştırma için önemlidir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, COMSTAT aracılığıyla değişen antimikrobiyal koşullar altında in vitro biyofilm yapılarının miktarını belirlemek için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlamaktır. Teknik, biyofilm kopyaları şeklinde büyütülen ve tobramisin ve anti-Psl monoklonal antikoru Psl0096'ya maruz bırakılan bir CF P. aeruginosa izolatı kullanılarak modellenmiştir. Adım adım yaklaşım, kullanıcı belirsizliğini azaltmayı ve önemli görüntü işleme adımlarını gözden kaçırma olasılığını en aza indirmeyi amaçlar. Spesifik olarak, protokol, görüntü segmentasyonu ve uygun nicel analiz fonksiyonlarının seçimi de dahil olmak üzere, COMSTAT'ın manuel çalışmasıyla ilişkili öznel varyasyonların ortadan kaldırılmasını vurgular. Bu yöntem, kullanıcıların COMSTAT'ı çalıştırmadan önce konfokal görüntüleri işlemek için ek zaman harcamasını gerektirse de, otomatik çıktılarda yanlış temsil edilen biyofilm heterojenisitesini en aza indirmeye yardımcı olur.

KF'li enfekte bir hastadan kültürlenen bir P. aeruginosa izolatı, in vitro biyofilm mimarisindeki antimikrobiyal kaynaklı değişiklikleri doğru bir şekilde ölçmede bu yaklaşımın güçlü yönlerini göstermek için kullanılır. Bu modelin genel iş akışı Şekil 1'de temsil edilmektedir. ImageJ'deki görüntü işleme ve COMSTAT analiz prosedürü Şekil 2'de gösterilmiştir. ImageJ'de görüntü segmentasyonu için bir CLSM z-s...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software at JoVE.com

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanılabilir.

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

quantifying-effects-antimicrobials-on-vitro-biofilm-architecture

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

3.2K Görüntüleme.  Hospital for Sick Children. Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanı...

Video: Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria are inoculated into the wells of a 96-well microtiter plate. In the case of the planktonic assay, serial dilutions of the antimicrobial agent of choice are added to the bacterial suspensions. In the biofilm assay, once inoculated, the bacteria are left to form a biofilm over a set period of time. Unattached cells are removed from the wells, the media is replenished and serial dilutions of the antimicrobial agent of choice are added. After exposure to the antimicrobial agent, the planktonic cells are assayed for growth. For the biofilm assay, the media is refreshed with fresh media lacking the antimicrobial agent and the biofilm cells are left to recover. Biofilm cell viability is assayed after the recovery period. The MBC-P for the antimicrobial agent is defined as the lowest concentration of drug that kills the cells in the planktonic culture.&#160; In contrast, the MBC-B for a strain is determined by exposing preformed biofilms to increasing concentrations of antimicrobial agent for 24 hr. The MBC-B is defined as the lowest concentration of antimicrobial agent that kills the cells in the biofilm.

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro using a 96-well microtiter plate. Planktonic or biofilm bacteria are exposed to serial dilutions of the antimicrobial agent of choice. Viability is assayed by growth on agar plates.

Planktonik Hücreler (MBC-P) ve Biyofilm Hücreleri (MBC-B) için Bir Antimikrobiyal Ajanın Minimal Bakterisidal Konsantrasyonunun Oluşturulması

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Biyomühendislik

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Antimikrobiyal Test ve Mikrobiyal Dinamik Analizi için Uyarlanabilir CF Modeli

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler