Yazarlar, bu araştırma için fon sağladığı için Kistik Fibrozis Vakfı'na teşekkür eder.

1. Bakteriyel izolat toplama
<ol><li>SickKids'te (Toronto) inhale tobramisin ile eradikasyon tedavisi gören KF'li pediatrik hastalardan oluşan bir kohorttan P. aeruginosa izolatları elde edin. İzolatları kullanımdan önce en az üç kez -80 ° C'de gliserol sitrat ve alt kültürde dondurun.</li>
</ol>2. İn vitro biyofilm oluşumu
NOT: Modifikasyonlarla in vitro biyofilm oluşumu için odacıklı bir kapak camı yöntemi1 kullanın. Bu modelin genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.
<ol><li>P. aeruginosa'yı triptik soya agar ve% 5 koyun kanı ile hazırlanan kan agar üzerinde 37 ° C'de gece boyunca izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Kanlı agardan 1-2 bakteri kolonisini 4 mL lizojeni et suyuna (LB) aşılayın. 225 rpm'ye ayarlanmış bir çalkalayıcıda 37 °C'de gece boyunca büyütün.</li>
	<li>4 mL taze LB içinde 40 μL kültür ekleyerek 1:100 oranında bir gece boyunca inokülum seyreltmesi hazırlayın. 600 nm'de (OD600) (erken günlük faz) yaklaşık 0,1'lik bir optik yoğunluk elde etmek için 225 rpm'ye ayarlanmış bir çalkalayıcıda 37 ° C'de 3-4 saat büyütün.</li>
	<li>220 μL aşılamayı 8 odacıklı bir kapak camı slaytının her bir oyuğuna aktarın. 37 ° C'de 24 saat boyunca rahatsız edilmeden inkübe edin.</li>
	<li>Biyofilmlerin tabanda ayrılmasını önlemek için ortamı her bir kuyucuktan yavaşça çıkarın. NOT: Sürgüyü 45°'lik bir açıyla öne doğru eğin ve pipet ucuyla tabana dokunmadan ortamı her odacıklı kuyunun alt köşelerinden aspire edin.</li>
	<li>100 μL 56 μg/mL floresan etiketli monoklonal antikor (mAb) hazırlayın ve yavaşça ekleyin. Bakteriyel antijen epitopuna antikor bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce, 56 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için floresan etiketli (kırmızı) mAb, Psl0096'yı LB cinsinden seyreltin. Psl0096, ilk hücre bağlanması ve yapısal bütünlükte yer alan P . aeruginosa biyofilmlerinin önemli bir EPS matris bileşeni olan sınıf I Psl epitopuna bağlanan bir anti-Psl mAb'dir (Cam003'ün optimize edilmiş afinite türevi)15.</li>
	<li>100 μL 1000 μg / mL antibiyotik çözeltisi hazırlayın ve yavaşça ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) belirtilen odacıklı kuyucukların yan tarafına. 37 ° C'de 24 saat boyunca rahatsız edilmeden inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce, 1000 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için LB'de 50 mg / mL tobramisin antibiyotik stoğunu seyreltin.</li>
</ol>3. Biyofilm floresan boyama
<ol><li>Canlı hücre boyama floresan boyanın 0.01 mM'lik bir çözeltisini hazırlayın. Ortamı odacıklı oyuklardan yavaşça çıkarın ve her bir oyuğa 200 μL boya karışımı ekleyin. Karanlıkta RT'de 45 dakika inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce, 2 mL LB'ye 4 μL 5 mM stok ekleyerek canlı hücre boyama (yeşil) floresan boyayı hazırlayın.</li>
	<li>Ortamı her kuyucuktan yavaşça çıkarın ve 2x'i 200 μL taze LB ile yıkayın.</li>
	<li>Her kuyucuğa 200 μL taze LB ekleyin ve konfokal mikroskopi ile incelemeye devam edin.</li>
</ol>4. Konfokal mikroskopi ile görüntü elde etme
NOT: Görüntü işleme ve COMSTAT analiz prosedürü Şekil 2'de sunulmuştur. Biyofilm boyamanın aynı gününde kuyuların görüntülerini elde edin. Görselleştirmedeki gecikme 1 saati aşarsa, odacıklı kapak camını daha fazla işleme kadar karanlıkta soğutun.
<ol><li>Uygun lazer uyarma dalga boylarına ve elde etmek için filtre setlerine sahip bir konfokal mikroskop sistemi ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak kuyuların görüntülerini elde edin. NOT: Burada, sırasıyla 561 ve 491 nm uyarma dalga boylarını kullanarak floresan etiketli (kırmızı) mAb ve canlı hücre (yeşil) boyasını uyarın.</li>
	<li>20-25x suya daldırmalı lens ile 0,3 μm'lik artışlarla katmanlı z yığını görüntüleri (alt tabakadan her bir biyofilm segmentinin tepesine kadar) yakalayın. Kuyu başına en az 6 görüntü yığını alın. NOT: Burada, görüntüleri 25x suya daldırma lensli yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanarak görselleştirin ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak işlenin (bkz. Malzeme Tablosu). Tek bir deneydeki tüm alımlar için yazılım kurulumunu ve dijital görüntüleme parametrelerini (yani parlaklık ve hassasiyet) sabit tutun.</li>
	<li>COMSTAT analizi için görüntüleri OME-TIFF olarak kaydedin. NOT: OME-TIFF'lerin her kanal için ayrı ayrı kaydedildiğinden emin olun (yani kırmızı ve yeşil). Bu adım, kullanılan görüntü analiz yazılımına bağlı olarak değişir.</li>
	<li>Bakteri izolatı başına toplam 3 biyolojik kopyadan (yani 3 bağımsız deney) görüntü yakalamak için 2.1–4.3 adımlarını tekrarlayın.</li>
</ol>5. COMSTAT analizi
NOT: ImageJ'ye bir eklenti (Comstat16,17) olarak yeniden yazılmış, ücretsiz olarak kullanılabilen bilgisayar programı COMSTAT 2'yi kullanarak görüntüleri nicel olarak analiz edin. İndirilen paketteki biyofilmlerin görüntü yığınlarını analiz etmek için genel talimatları okuyun. Bu katkı, antimikrobiyallerin biyofilm oluşumu üzerindeki etkilerini ölçmek için önerilen seçilmiş ImageJ işleme adımları ve COMSTAT özellikleri ile özetlenmiş bir protokol sağlar.
<ol><li>Comstat2 paketini http://www.comstat.dk/'dan indirin. Yüklü klasörün içinde ImageJ'yi bulun ve çalıştırın.</li>
	<li>Masaüstünde bir kaynak klasör oluşturun ve klasöre tek bir OME-TIFF ekleyin.</li>
	<li>Kaynak klasörden OME-TIFF'i açın ve biyokütle içermeyen boş katmanları silin. Bu katmanlar, z-yığınının ilk veya son birkaç katmanı olacaktır. NOT: Mikroskop tanımlı z-yığını sınırları bazen kullanıcılar tarafından fazla tahmin edilir. Bu boş katmanları silmek, COMSTAT analizi için daha rafine bir z-yığını sınırı oluşturur.</li>
	<li>Dosya | İthalat | Görüntü Sırası. Kaynak klasörü bulun, açmadan vurgulayın ve Seç'e tıklayın. Bir 'Sıra Seçenekleri' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. NOT: ImageJ'de ek görüntüleri içe aktarmak için önce önceki OME-TIFF'i kaynak klasörden kaldırın, ardından yeni OME-TIFF'i klasöre ekleyin ve 5.3 ve 5.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Görüntü | öğesini seçerek biyofilmin yönünü çevirin Dönüştür | Alt tabakayı ilk (en üst) yığın olarak konumlandırmak için Z'yi çevirin. NOT: COMSTAT algoritmaları, biyofilmleri z yönünde yukarıdan (yığın 1) aşağıya doğru okur. Kullanılan konfokal mikroskop sistemine bağlı olarak, OME-TIFF çıkışı ters çevrilebilir. Bu nedenle, çıktı verilerinin kusurlu hale gelmesini önlemek için alt tabakayı görüntü yığını 1 olarak konumlandırarak dilimlerin sırasını tersine çevirmek önemlidir.</li>
	<li>Görüntü | Özellikleri. Bir 'Kaynak' penceresi görünecektir.<ol><li>'Uzunluk Birimi'ni 'mikron' olarak belirtin.</li>
		<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak 'Piksel genişliği' ve 'Piksel yüksekliği'ni matematiksel olarak belirleyin: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61759/61759equ01.jpg"> (1) Burada, 'Piksel genişliği' ve 'Piksel yüksekliği' 0,427 olarak tanımlanır, burada şarj bağlantılı cihazdaki (CCD) bir pikselin fiziksel uzunluğu 16 μm'dir; toplam büyütme 25x'tir; ve büyüteç konumu 1.5x'tir. NOT: Piksel başına hücre boyutunu hesaplamak için kullanılan denklem, mikroskop kamera üreticisine bağlı olarak değişebilir. Alternatif olarak, 'Piksel genişliği' ve 'Piksel yüksekliği' uzamsal kalibrasyon ile tanımlanabilir (https://imagej.net/Spatial_Calibration bakın).</li>
		<li>'Voksel derinliğini' 0,3 olarak tanımlayın (yani, her z-yığını katmanı arasındaki artımlı boşluk). 'Kaynak' penceresinde Tamam'ı seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntü | öğesini seçerek görüntü eşiğini ayarlayın Ayarla | Eşik. Bir 'Eşik' penceresi görünecektir. NOT: Görüntüdeki nesneler gri tonlamalı bir arka planla kırmızı görünecektir. Alternatif olarak, 'Kırmızı'yı 'S&B' olarak değiştirmek için 'Eşik' penceresindeki açılır menüyü kullanarak eşik siyah beyaz olarak ayarlanabilir.<ol><li>Görüntü penceresinde, kaydırıcıyı en sağa ayarlayın (yani, biyofilmin en üst katmanı). Arka plan gürültüsünü gidermek için, maksimum ve minimum eşik değerlerini manuel olarak ayarlamak için görüntünün histogramını görüntüleyen 'Eşik' penceresini kullanın. İlk olarak, alt kaydırıcıyı mümkün olduğunca sağa ayarlayarak maksimum eşik değerini ayarlayın. İkinci olarak, görüntüyü iki ayrı faza ayıran minimum eşik değerini ayarlamak için üst kaydırıcıyı kullanın: kırmızı biyokütle ve gri tonlamalı arka plan (Şekil 3). NOT: Burada açıklanan in vitro biyofilm oluşumu ve floresan mikroskopi prosedürü, ideal durumda OME-TIFF'ler oluşturur ve görüntülerin basit bir histogram eşik yöntemi aracılığıyla iki ayrı faza bölünmesine izin verir. Bununla birlikte, bazı durumlarda, farklı fazlar arasındaki histogram ayrımı o kadar net değildir. Bunun nedeni, yoğun arka plan gürültüsünün varlığı, değişen arka plan yoğunlukları veya biyokütle ile arka plan arasındaki düşük yoğunluklu kontrast olabilir. Bu gibi durumlarda, kullanıcılar gelişmiş bir segmentasyon prosedürübenimsemelidir 18,19.<ol><li>Alternatif olarak, 'Eşik' penceresinde 'Varsayılan' olarak ayarlanan sol açılır menüyü kullanarak tek tek görüntüler için eşikleri algoritmik olarak ayarlayın. Bu özellik, aralarından seçim yapabileceğiniz 17 farklı algoritmik eşik seçeneği sunar (https://imagej.net/Auto_Threshold bakın). En uygun seçeneği seçin, ardından eşiği ayarlamak için 'Otomatik'i seçin.</li>
		</ol></li>
		<li>Eşik değerleri ayarlandığında, arka plan gürültüsünün baştan sona yeterince giderildiğinden emin olmak için her katmanda gezinmek için görüntü penceresindeki kaydırıcıyı kullanın.</li>
		<li>Önce alt eşik değerini düzeltmek için 'Eşik' penceresinde Ayarla'yı seçin. Bir 'Eşik Düzeylerini Ayarla' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. Yeniden Ayarla'yı seçin ve maksimum eşik değerini sabitlemek için bu adımı tekrarlayın. NOT: Her 'Ayarla' seçildiğinde, alt kaydırıcı otomatik olarak ayarlanabilir. Bu gibi durumlarda, kaydırıcıyı manuel olarak yeniden ayarlayın (veya algoritmik eşiklerden birini kullanıyorsanız 'Otomatik'i seçin) ve 5.6.2–5.6.3 adımlarını tekrarlayın. Ana fikir, kaydırıcılar otomatik olarak yeniden ayarlandığında, hem üst hem de alt eşiklerin sabitlendiğinden emin olmak için 'Ayarla'nın daha sonra iki kez daha seçilmesi gerektiğidir.</li>
		<li>Uygula'yı seçin ve 'Yığını İkiliye Dönüştür' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin ve ardından 'Eşik' penceresinden çıkın.</li>
		<li>Eklentiler | Biyo-Formatlar | Biyo-Format İhracatçısı|. Yeni bir dosya adı girin ve kaynak klasöre OME-TIFF olarak kaydedin. Bir 'Biyo-Format Dışa Aktarıcı - Birden Çok Dosya' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. Bir 'Biyo-Format Dışa Aktarıcı Seçenekleri' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. NOT: COMSTAT analizine geçmeden önce kaynak klasöre yalnızca yeni ayarlanan siyah beyaz OME-TIFF'lerin kaydedildiğinden emin olun. Tüm orijinal OME-TIFF'leri klasörden kaldırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Eklentiler | Comstat2 |. Bir 'Hakkında' penceresi görünecektir. Tamam'ı seçin. Üç pencere görünecektir.<ol><li>'Gözlemlenen Dizinler' penceresinde (sağ üstte), Ekle'yi seçin. Kaynak klasörü bulun, açmadan vurgulayın ve Seç'i seçin. COMSTAT aracılığıyla analiz edilecek OME-TIFF'leri listeleyen bir 'Dizinlerdeki Görüntüler' penceresi (sol üstte) görünecektir.</li>
		<li>'Comstat 2.1' penceresinde (sağ altta), yazılımın daha önce ayrı OME-TIFF'ler için ayarlanmış eşik değerlerini kullandığından emin olmak için 'Otomatik eşikleme (Otsu yöntemi)' seçimini kaldırın. Ayrıca, biyofilm yapısının boşluklarında bulunan serbest yüzen hücrelerin veya biyokütlenin çok ince kısımlarının analize dahil edildiğinden emin olmak için Bağlı Hacim Filtresig (CVF) seçimini kaldırın. NOT: Burada, CVF'nin seçimini kaldırın çünkü COMSTAT analizi çok erken biyofilmler (24 saatlik başlangıç büyümesi) ve antimikrobiyal tedaviden sonra kalan planktonik hücreler/koloniler üzerinde gerçekleştirilir. Olgun biyofilmler için, yalnızca biyofilm yapısına bağlı biyokütlenin miktarının ölçülmesini sağlamak için CVF'yi seçin.</li>
		<li>'Comstat 2.1' penceresinde (sağ altta), kantitatif analiz için istediğiniz özellikleri seçin. Burada Biyo Kütle, Kalınlık Dağılımı ve Yüzey Alanı'nı seçin. Programı çalıştırmak için Git'i seçin. 'Günlük' penceresinde (sol altta), çıktı verileri 'Seçilen işlevler/görüntüler ile tamamlandı!' görünene kadar işlenirken gösterilir. COMSTAT ölçümlerini kaydedin. Bu ölçümler ayrıca otomatik olarak kaynak klasörüne TXT dosyaları olarak kaydedilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+infections:+community+structure,+antimicrobial+tolerance+and+immune+response.">Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response.</a> Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).</li><li>Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+diversity+of+environmental+GIM-1-producing+bacteria+collected+during+a+long-term+outbreak.">Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Powell, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+extracellular+polymeric+network+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+alginate+oligosaccharides.">Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. &. #. 2. 1. 6. ;., Wang, H., H&#248;iby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance,+respiratory+tract+infections+and+role+of+biofilms+in+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).</li><li>Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-Pseudomonas+aeruginosa+interactions+promote+biofilm+formation+and+antibiotic+resistance.">Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance.</a> Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).</li><li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+interaction+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+enhances+tobramycin+resistance.">Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).</li><li>Rojo-Molinero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+biofilms+with+aztreonam+and+tobramycin+is+a+novel+strategy+for+combating+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+respiratory+infections.">Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).</li><li>Hentzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function.">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).</li><li>Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+chambers.">Growing and analyzing biofilms in flow chambers.</a> Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).</li><li>Luo, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sensitive+thresholding+method+for+confocal+laser+scanning+microscope+image+stacks+of+microbial+biofilms.">A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms.</a> Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).</li><li>Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+effects+of+sputum+on+biofilm+development+using+a+chambered+coverglass+model.">Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54819 (2016).</li><li>DiGiandomenico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broadly+protective+human+antibodies+to+Pseudomonas+aeruginosa+exopolysaccharide+Psl+by+phenotypic+screening.">Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li><li>Vorregaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comstat2+-+a+modern+3D+image+analysis+environment+for+biofilms,+in+Informatics+and+Mathematical+Modelling.">Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling.</a> Technical University of Denmark. , (2008).</li><li>Hashemi, M. A., Khaddour, G., Fran&#231;ois, B., Massart, T. J., Salager, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tomographic+imagery+segmentation+methodology+for+three-phase+geomaterials+based+on+simultaneous+region+growing.">A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing.</a> Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).</li><li>Rogowska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+and+fundamentals+of+medical+image+segmentation.">Overview and fundamentals of medical image segmentation.</a> Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).</li><li>Webb, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+technician+effects+when+extracting+quantities+from+microscope+images.">Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images.</a> Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).</li><li>Xavier, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+threshold+selection+procedure+(OTS)+for+segmentation+of+scanning+laser+confocal+microscope+images.">Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images.</a> Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).</li><li>Arena, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+cell:+turning+images+into+numbers+with+ImageJ.">Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260 (2017).</li><li>Daims, H., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+uncultured+microorganisms+by+fluorescence+microscopy+and+digital+image+analysis.">Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).</li><li>Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+procedure+for+automatic+and+accurate+segmentation+of+volumetric+CLSM+biofilm+images.">A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images.</a> Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+biofilms+formed+by+nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).</li><li>Stapper, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+production+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development+and+architecture,+but+is+not+essential+for+biofilm+formation.">Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation.</a> Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).</li><li>Reichhardt, C., Parsek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+architecture+and+matrix+localization.">Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 677 (2019).</li><li>Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+biofilm+structure+using+image+analysis.">Quantifying biofilm structure using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).</li><li>Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biofilm+image+thresholding+methods.">Evaluation of biofilm image thresholding methods.</a> Water Research. 35, 1149-1158 (2001).</li><li>Ross, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+confocal+images+of+biofilms+grown+on+irregular+surfaces.">Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces.</a> Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+development+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix.">Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> PLoS Pathogens. 5, (2009).</li><li>Mah, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426, 306-310 (2003).</li><li>Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrients+determine+the+spatial+architecture+of+Paracoccus+sp.+biofilm.">Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm.</a> Biofouling. 26, 449-459 (2010).</li><li>Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenazines+affect+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+in+similar+ways+at+various+scales.">Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales.</a> Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).</li><li>Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa+conditional+psl+variants+reveals+roles+for+the+psl+polysaccharide+in+adhesion+and+maintaining+biofilm+structure+postattachment.">Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment.</a> Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).</li></ol>

İn vitro biyofilm yapılarının üç boyutlu görüntülerini kantitatif olarak karşılaştırmak için önceden belirlenmiş bir yöntem yoktur ve bu bağlamda açıklanan prosedürlerin, operatörler arası değişkenlik nedeniyle standartlaştırılması genellikle zordur20. Bu nedenle, bu protokol, değişen antimikrobiyal koşullar altında in vitro biyofilm mimarisindeki değişiklikleri ölçmek isteyen COMSTAT uygulamaları için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve ...

Biyofilmler, kendi kendine üretilen hücre dışı polimerik maddelerden (EPS) oluşan bir matrise yönlendirilmiş mikroorganizma kümeleridir. EPS matrisi çok karmaşıktır, esas olarak bakteri hücreleri, su, proteinler, polisakkaritler, lipitler ve nükleik asitlerden1 oluşur ve bunların tümü biyofilmleri serbest yaşayan planktonik hücrelerden belirgin şekilde farklı kılar. Biyofilm EPS birbirine ve çeşitli yüzeylere yapışır. EPS matrisi, hücreler arası sinyalleşme ve savunma2 için kullanılan metabolitlerin, genetik materyalin ve bileşiklerin hücreden hücreye değişimine aracılık eden özelliklere sahiptir. Bu özellikler toplu olarak biyofilmlerin yapısal bütünlüğü ve dış stres faktörlerine karşı koruma sağlayarak bağışıklıktan kaçınmaya ve antimikrobiyal dirence katkıda bulunur3.
Pseudomonas aeruginosa, antimikrobiyallere yanıt olarak kaçış amaçlı bir biyofilm büyüme stratejisi benimsediği bilinen, iyi bilinen bir nozokomiyal patojendir. Bunun en iyi örneği, resesif genetik bozukluk olan kistik fibroz (KF) olan hastalarda görülür. Biyofilmler, antimikrobiyal dirençli P. aeruginosa4'ün gelişiminde çok önemli bir rol oynar ve KF'li hastalarda kronik akciğer enfeksiyonunun oluşmasına izin vererek akciğer fonksiyonlarında hızlı düşüşe ve erken mortaliteyeneden olur 5. Bu nedenle, CF 6,7 olan hastalardan elde edilen P. aeruginosa izolatlarına karşı antibiyotiklerin ve yeni anti-enfektif ajanların etkinliğini test etmek için in vitro biyofilm çalışmaları yapılmaktadır. Biyofilm oluşumunu takiben, antimikrobiyaller yapıya dışarıdan uygulanır ve biyofilm segmentlerinin yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu rekonstrüksiyonlarını oluşturmak için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılır. Daha sonra, biyofilm mimarisindeki değişiklikleri ölçmek için ImageJ'ye bir eklenti olarak bilgisayar yazılımıCOMSTAT'ı kullanmak yaygın bir uygulamadır 8,9,10,11.
COMSTAT, biyofilm yapısını ölçmek için yararlı olsa da, görüntü analizinin tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu daha az yaygın olarak ele alınmaktadır. Örneğin, COMSTAT çalıştırılmadan önce gerçekleştirilen görüntü işleme prosedürü nesneldir, ancak görüntü eşikleri12,13 ayarlanırken bir öznellik öğesi içerir. Benzer şekilde, COMSTAT programı, operatörün görüntü segmentasyonu için temel koşullardan gelişmiş koşullara ve parametrelere ve ayrıca on nicel analiz fonksiyonuna (örneğin, kalınlık dağılımı, yüzey alanı, biyokütle, boyutsuz pürüzlülük katsayısı) seçim yapmasına olanak tanır. Değişen operatör uzmanlık seviyeleriyle birleşen çok sayıda kullanıcı seçeneği, biyofilm davranışının yanlış yönlendirilmiş raporlanmasına neden olabilir.
Bu nedenle, bu protokolün amacı, COMSTAT kullanılarak in vitro biyofilm yapılarının kantitatif karşılaştırması için nispeten basit bir yöntem sunmaktır. Burada, bir CF P. aeruginosa izolatından alınan biyofilm segmentlerinin üç boyutlu görüntüleri, tekrarlanabilir in vitro biyofilm deneyleri gerçekleştirmek için kullanılan yerleşik bir teknik olan odacıklı kapak camı modeli14 kullanılarak CLSM aracılığıyla yakalanır. COMSTAT'ı ImageJ'e bir eklenti olarak kullanan bu yöntem, araştırmacıların değişen koşullar altında antimikrobiyallerin varlığında biyofilm mimarisindeki değişiklikleri nicel olarak tanımlamasına olanak tanır. Genel olarak, bu yöntem, COMSTAT'ın manuel olarak çalıştırılmasıyla ilişkili öznel varyasyonları ortadan kaldırmayı ve böylece protokollerin merkezler arasında standardizasyonunu kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Psl mAb, Psl0096</td>
			<td>Medimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>LBL666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin, 900 &#181;g/mg</td>
			<td>Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J66040</td>
			<td>It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum Volocity 6.3</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the effects of antimicrobials on in vitro biofilm architecture using comstat software

Biyofilmler, koruma ve yapısal bütünlük için kendi ürettiği hücre dışı polimerik madde matrisine dayanan mikroorganizma kümeleridir. Nozokomiyal patojen Pseudomonas aeruginosa'nın , kistik fibrozisli (KF) hastalarda kronik akciğer enfeksiyonuna neden olan bir biyofilm büyüme modunu benimsediği bilinmektedir. Bilgisayar programı, COMSTAT, üç boyutlu konfokal görüntülerden veri çıkararak P. aeruginosa biyofilm mimarisindeki antimikrobiyal kaynaklı değişiklikleri ölçmek için yararlı bir araçtır. Bununla birlikte, yazılımın standartlaştırılmış çalışması daha az yaygın olarak ele alınır, bu da biyofilm davranışının en iyi şekilde raporlanması ve merkezler arası karşılaştırma için önemlidir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, COMSTAT aracılığıyla değişen antimikrobiyal koşullar altında in vitro biyofilm yapılarının miktarını belirlemek için basit ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlamaktır. Teknik, biyofilm kopyaları şeklinde büyütülen ve tobramisin ve anti-Psl monoklonal antikoru Psl0096'ya maruz bırakılan bir CF P. aeruginosa izolatı kullanılarak modellenmiştir. Adım adım yaklaşım, kullanıcı belirsizliğini azaltmayı ve önemli görüntü işleme adımlarını gözden kaçırma olasılığını en aza indirmeyi amaçlar. Spesifik olarak, protokol, görüntü segmentasyonu ve uygun nicel analiz fonksiyonlarının seçimi de dahil olmak üzere, COMSTAT'ın manuel çalışmasıyla ilişkili öznel varyasyonların ortadan kaldırılmasını vurgular. Bu yöntem, kullanıcıların COMSTAT'ı çalıştırmadan önce konfokal görüntüleri işlemek için ek zaman harcamasını gerektirse de, otomatik çıktılarda yanlış temsil edilen biyofilm heterojenisitesini en aza indirmeye yardımcı olur.

KF'li enfekte bir hastadan kültürlenen bir P. aeruginosa izolatı, in vitro biyofilm mimarisindeki antimikrobiyal kaynaklı değişiklikleri doğru bir şekilde ölçmede bu yaklaşımın güçlü yönlerini göstermek için kullanılır. Bu modelin genel iş akışı Şekil 1'de temsil edilmektedir. ImageJ'deki görüntü işleme ve COMSTAT analiz prosedürü Şekil 2'de gösterilmiştir. ImageJ'de görüntü segmentasyonu için bir CLSM z-s...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software at JoVE.com

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanılabilir.

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

quantifying-effects-antimicrobials-on-vitro-biofilm-architecture

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

3.1K Görüntüleme.  Hospital for Sick Children. Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanı...

Video: Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are needed to decipher the utilization of microbiome modulators for human health benefits. However, the large-scale screening and optimization of modulators to validate microbiome modulation and predict related health benefits may be practically difficult due to the need for large number of animals and/or human subjects. To this end, in vitro or ex vivo models can facilitate preliminary screening of microbiome modulators. Herein, it is optimized and demonstrated an ex vivo fecal microbiota culture system that can be used for examining the effects of various interventions of gut microbiome modulators including probiotics, prebiotics and other food ingredients, aside from nutraceuticals and drugs, on the diversity and composition of the human gut microbiota. Inulin, one of the most widely studied prebiotic compounds and microbiome modulators, is used as an example here to examine its effect on the healthy fecal microbiota composition and its metabolic activities, such as fecal pH and the fecal levels of organic acids including lactate and short-chain fatty acids (SCFAs). The protocol may be useful for studies aimed at estimating the effects of different interventions of modulators on fecal microbiota profiles and at predicting their health impacts.

This protocol describes an in vitro batch-culture fermentation system of human fecal microbiota, using inulin (a well-known prebiotic and one of the most widely studied microbiota modulators) to demonstrate the use of this system in estimating effects of specific interventions on fecal microbiota composition and metabolic activities.

Bir In vitro Batch-kültür modeli ınsan dışkı microbiota üzerinde girişimsel rejimlerin etkilerini tahmin etmek

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...