妊娠期間の短い生物として、ショウジョウバエのメラノガスターの胚は、発生中のタンパク質およびその調節因子の分布および局在を調査するための主要な研究対象である。しかし、脂質が豊富な胚とキチンが豊富な絨毛膜のために、その有用性はガラス表面に胚を取り付けることの難しさによって制限される。本研究では、ショウジョウバエ胚のスライドへの付着を著しく増強する実用的な方法を紹介し、組織化学、免疫組織化学、in-situハイブリダイゼーションを成功させるための方法を詳述する。
ここに示す手順の前に、スライドを洗剤で洗浄し、水道水と蒸留水ですすぎ、オーブンに入れて乾燥させる必要があります。乾燥スライドは、すすぎ洗いをしてから再び乾燥させる前に、重クロム酸カリウムに24時間穏やかに浸してから、95%エタノールに少なくとも2時間入れるべきである。このステップでは、当社の方法に従って、さらにスライドまたはクロムミョウバンゼラチンを調製することができます。
ゼラチンは、その後、使用前に60度の浴水に保存することができる。スライドをコーティングするには、スライドの片方の端に少量のゼラチンを落とします。次に、別のスライドガラスを使用して、コーティングするスライドの表面全体にゼラチンをゆっくりと均等にドラッグします。
これにより、薄くて均一なレイヤーが作成されます。ラックまたは乾燥装置に入れる前にオーブンに保管し、別の一晩または48時間の完全な乾燥を可能にする。胚は、ブドウ果汁寒天プレートを用いて採取され、一旦準備ができたら、ブドウ果汁寒天プレートは、その後、除去され得る。
プレートをPBSであふれさせ、柔らかいブラシで優しくブラッシングして、付着した胚を取り除きます。PBSを含む胚を1.5ミリリットルの遠沈管に取り出し、氷上で休ませる。胚が氷上に落ち着いたら、上清PBSを静かに取り除く。
チューブの底にある胚を乱さないように注意してください。サンプルに50%漂白剤1mLを加え、2分間静かに振る。濾過により漂白剤を除去し、PBSで胚を3回洗浄した。
n-ヘプタンを準備する。準備ができたら、ろ紙から胚をn-ヘプタンに洗浄し、ろ紙を溶液中で穏やかに振る。胚がn-ヘプタンプレートの底に沈降するのを許し、このn-ヘプタンを新しい1.5ミリリットルの遠沈管に集める。
1ミリリットルのメタノールをチューブに加え、溶液を沈殿させてから、n-ヘプタンメタノールを吸引する。胚をPBSで3~5回洗浄し、残留メタノールを除去した。この余分なPBSを取り除き、Bouinの固定剤を加え、胚を固定するために30〜60分間落ち着くのを許します。
ブアンの固定液を取り除き、PBSで再び胚を3回洗浄する。PBS中に1.2%アガロースを調製し、60度の水浴中で保温し、それが保存されている余分なPBSを穏やかに吸引することによって包埋のための胚を準備する。底部の胚を乱さないように注意し、次いで溶液の底部にある胚プラグを吸引し、ボトルキャップ型に静かに置く。
1.2%アガロースゲルを加える前に、この型から追加のPBSを吸引する。これらのアガロースプラグを保存するためにPBSの溶液を調製する。アガロースが固まったら、個々のプラグをこのPBSに移動して保管することができます。
ここでは逐次脱水工程を示している。毎回インキュベーションに15分間許可する。次いで、100%エタノールから取り出し、エタノールとキシレンの1対1の溶液中でさらに15分間固定する。
この1対1の溶液から取り出したら、純粋なキシレンで1分間除去します。これで、組織サンプルを加温した1対1のキシレンパラフィン溶液に移動する準備が整いました。100%パラフィンに最終的に埋め込む前に30分間座らせてください。
100%パラフィンの最初のものに移動し、2時間休む。このプロセスを2つと3つのパラフィンで繰り返します。これで、サンプルを金型に移動させる準備ができ、金型をワックスで満たして埋め込みプロセスを完了します。
ショウジョウバエ胚の埋め込み。ショウジョウバエ胚の調製したパラフィン切片を60度のオーブンに15分間置く。キシレンの100%溶液に入れます。
その後、水分補給を開始します。これらの各ソリューションにスライドをそれぞれ3分間置きます。スライドを蒸留水に入れたら、ヘマトキシリン溶液に2分間入れます。
完了したら、スライドからできるだけ多くの溶液を排出してください。スライドを蒸留水で洗浄したら、スライドをエオジンで1分間染色します。最後に、エオジンからスライドを取り出し、蒸留水で洗う。
このスライドがきれいになったら、最後の脱水プロセスを開始します。最後にキシレン100%に5分間入れた。このプロセスを100%キシレンの2つの新しい溶液中で繰り返し、スライドの一方の端に沿って少量の中性ガムを滴下する。
このカバースリップを取り、スライドの片方の端にそっと置きます。まずキシレン100%に入れてスライドを脱パラフィンする。スライドを蒸留水から取り出したら、1%過ヨウ素酸溶液で覆う必要があります。
その後、余分な溶液を捨て、蒸留水ですすいでください。スライドを予熱した溶液に直接入れる。これが完了したら、スライドを蒸留水ですすぎ、溶液を0.2%塩化金で1〜2分間着色します。
次に、蒸留水を用いて3%チオ硫酸ナトリウムで3分間組織を固定した。そして、ヘマトキシリンで対比染色する。対比染色後、ここに示すように蒸留水のいずれかのチューブで染色を洗浄することができる。
それから私達は脱水プロセスに移ります。スライドを100%キシレンに直接入れてから、スライドの角に少量のニュートラルガムを塗ります。カバースリップで優しく覆います。
スライドの準備を、脱パラフィン処理とキシレンによって以前と同様に開始します。次いで、1対1のキシレンエタノール中である。スライドが脱パラフィンされたら、組織を再水和し始め、最後にPBSで水分補給を開始します。
スライドをメタノールで作った0.3%過酸化水素に10分間置きます。次いで、スライドを20mLの標的検索溶液で覆う。スライドは染色ボックスに入れることができます。
ステナーボックスをスチーマーに入れ、溶液が逃げないようにし、スライドが完全に覆われていることを確認してください。蒸しプロセス中に水蒸気が逃げることができるように、汚れ箱の蓋を完全に閉じてはならないことに注意してください。その後PBS-Tで3回穏やかにすすいだ。
余分な溶液を破棄し、今度はPBSでこのプロセスを繰り返します。次に、スライドを過酸化物ブロック中で5〜10分間インキュベートし、PBS-Tで数回、次にPBSで数回すすいだ。抗体を準備し、組織に直接滴下する。
これらの組織は、その後、インキュベートするか、または室温で4時間培養することができる。二次抗体は室温で90分間インキュベートし、5%DABで2~10分間染色する必要があります。適切な色が得られたら、蒸留水ですすぎ、次いでヘマトキシリンで対比染色する。
このヘマトキシリン染色の後、スライドを順次脱水することができる。スライドを100%キシレンに入れ、3分間浸します。次に、少量のニュートラルガムをスライドの片端に落とします。
ガムを置いたら、スライドカバーを取り、スライドの片方の端からそっと置きます。精製された直鎖状化鋳型DNAの1マイクログラムを滅菌RNase非含有反応バイアルに加える。次に、RNaseフリーのDEPC処理二重蒸留水を十分加えて、総サンプル量を13マイクロリットルにします。
その後、短時間遠心分離し、摂氏37度で2時間インキュベートする。RNase保護実験では、鋳型DNAを除去するために、RNaseフリーのDnase-1を2マイクロリットル使用して15分間インキュベートすることをお勧めします。インキュベーション工程が完了したら、pH8で0.2モルEDTAを2マイクロリットル加えて反応を停止させる。
ここに示す手順の前に、スライドは、以前に実証したプロトコルに従って、脱パラフィン処理および再水和されました。再水和後、スライドを1リットル当たり0.01モルのPBS中でpH7.4でそれぞれ5分間インキュベートし、組織から固定液を除去した。PBSでリンスした後、次に1リットル当たり100ミリモルのグリシン溶液で5分間2回リンスし、組織から遊離アルデヒド基を除去した。
このステップの後、スライドをPBSで5分間すすいでください。次に、すすぎの前に0.3%トリトンX-100を含むPBS中で15分間インキュベートし、次いでプロテイナーゼK.Nextのマイクロリットルあたり1マイクログラムで再度インキュベートし、4%パラホルムアルデヒドおよびPBSでスライドをpH7.2で3分間固定する。次いで、インキュベート前にスライドを、0.25%無水酢酸を含むpH8の0.1モルトリエタノールアミン緩衝液で洗浄する。
この段階でボックスを傾けて、ソリューションを完全にカバーすることができます。ボックスは、乾燥ハイブリダイゼーションボックスの底に20%グリセロールまたはDEPC水を加えることによって調製される。次に、スライドを20マイクロリットルのプレハイブリダイゼーション溶液で覆う。
サーモンの精子DNAを、各スライドに1ミリリットル当たり100マイクログラムの濃度で投与する。その後、摂氏42度で4時間インキュベートします。これは、このプロセス中に溶液が乾燥しないように、予め準備された加湿ボックス内で行われる。
ハイブリダイゼーション後の段階では、ハイブリダイゼーション溶液をサンプルから完全にすすぐことが非常に重要です。これは、37度で15分間の連続すすぎで、4倍濃度SSCを用いて、2倍濃度1倍濃度、0.5倍濃度および0.1倍濃度SSC溶液を用いて行うことができる。それぞれ摂氏37度で15分間インキュベートする。
これを行った後、PBSで3回、それぞれ5分間洗浄してから洗浄バッファーを加えます。洗浄バッファーは、次の手順の前に 1 分間すすぎます 次の溶液を追加する前に、洗浄バッファーがスライドから完全に乾燥していることを確認してください。各スライドに100ミリリットルのブロッキング溶液を加え、スライドを30分間インキュベートする。
これは、良好な染色を確実にするために、光のない環境で行うのが最善です。次にスライドを20mLの抗体溶液中で再び30分間インキュベートする。抗体溶液をスライドに直接塗布して、組織を完全にカバーします。
インキュベーションが完了したら、100ミリリットルの洗浄バッファーを塗布します。光のない条件下で15分間インキュベートし、未結合の抗体コンジュゲートを除去した。洗浄バッファーを取り外します。
次に、20ミリリットルの検出バッファーを塗布し、約4分間インキュベートさせた。4 分後、検出バッファーを削除します。スライドを乾燥させて追加の溶液がないようにし、新しく調製したカラー基質溶液を10ミリリットル加える。
この反応は数分以内に始まりますが、16時間後に完了します。だから、光のない状態でその期間インキュベートすることを許可してください。バンドが検出される目的のスポットが見つかったら、スライドを 50 ミリリットルの TE バッファーで洗浄して反応を停止します。
そして、以前に示した脱水プロセスと中性ガムの取り付けプロセスを完了します。図1および図2は、ショウジョウバエ胚におけるパラフィン切片に対するクロムアルミニウムゼラチンコーティング方法およびFKBP12およびDmFKBP12の発現プロファイルに対する埋め込み方法を実証する。図3は、合胞体細胞芽細胞ステージで検出されたFKBP12の抗体のタンパク質分布を示す。
これらの組織化学的結果から、FKBP12発現は合胞胚葉において分極が少なく、次いで栄養胚葉上皮の下の基底膜内に局在し始め、前極および後極に見られるより多くの発現で勾配を知らせることがわかる。ショウジョウバエ胚の初期および後期のガス関係段階に続く図4は、FKBP12タンパク質が原始胚組織の特定の建築成分に制限されるようになることを示している。早期および後期胃胚期に観察されたものよりも少ない細胞外分布を有する。
興味深いことに、上述の動的タンパク質分布は、図5に見られるようにFKBP12のMRIレベルの対応する変化を伴わない。タンパク質発現が未だ知られていない転写後分子機構の結果であることを示す。リアノジン受容体媒介カルシウムシグナル伝達は、脊椎動物および無脊椎動物の両方の多くの生理学的および病理学的プロセスにおける基本的な経路である。
この遺伝子の変異は、疾患または早期心臓死につながる多くの生理学的障害を引き起こすことが知られている。しかし、この遺伝子がショウジョウバエの初期の発生に果たす役割を研究することは困難でした。胚の通過成分として、脂質が豊富な胚およびキチンが豊富な絨毛膜は、ショウジョウバエの発生初期におけるタンパク質および胚発現の研究を困難にする。
この論文で説明したスライドコーティング、胚の埋め込み、および免疫組織化学的技術により、リアノジン受容体タンパク質およびmRNAの動的分布を詳細に研究することができました。私たちはこれらの技術を共有し、ショウジョウバエの初期段階で他の人が他のタンパク質を研究できるようにするという希望を共有しています。
