異なる脳領域を研究することは、脳の分子的および構造的複雑さを理解するための足がかりです。このプロトコルは、異なる脳領域を分離するためのマウス脳の体系的な解剖を記述します。脳の解剖学の観点からは、簡単に再現できるトップダウンアプローチです。
このプロトコルの利点は2つあります。まず、このアプローチは、小さいながらも重要な脳領域の分子基盤を理解する機会を提供します。第二に、この解剖プロセス全体は、バックアッセイおよび分子アッセイの重要な前提条件である分子完全性の維持を確実にするために十分に短いです。
この手順には、練習と繊細な取り扱いが含まれます。ここでは、構造上のランドマークを維持するためにタイミングが非常に重要であり、適切なトレーニングと練習で達成できます。マウスの脳除去の手順を実証するのは、私たちの研究室の研究化学者でありバイオインフォマティシャンであるSeid Muhieです。
マウスの脳解剖の手順をさらに実証するのは、私たちの研究室の神経科学者であるジェームズ・マイヤーホフです。まず、しっかりと握るために皮膚をきれいにして取り除きます。斬首された頭の上顎を止血剤で固定し、ガーゼを使用して頭皮を吻側に反射させます。
細かい湾曲したハサミを大孔に挿入して、付着した髄膜を分離します。次に、脊髄が通過する頭蓋骨の基部の開口部にハサミを挿入し、刃を垂直に向けますが、基底板骨の内面に平行に押し付け、刃を左側に45度回転させ、次に右側に回転させます。頭頂内骨の後頭骨を取り除き、小脳を露出させます。
はさみを矢状縫合糸の中央に沿って吻側方向にブレグマまで進め、大脳皮質の裂傷を避けるために上方に持ち上げて切ります。頭頂骨が持ち上げられたら、残りの髄膜付着物を特定して切断します。矢状面に2つの平行な切り込みを入れ、脳表面の裂傷を避けて前頭骨の断片を取り除きます。
髄膜の付着物と脳神経を切断しながら、頭蓋骨を反転させて、重力が生理食塩水で事前に満たされた小さなカップへの脳の除去を支援できるようにします。下垂体の解剖学的構造が識別できるように、聴覚ブラを無傷に保ちます。下垂体をその場所に保持している膜テントの尾根の両側に非常に小さな傍矢状切り込みを入れ、超微細鉗子で下垂体の後葉を持ち上げます。
最も近い三叉神経の下垂体前葉の外側縁の間に矢状切開を行い、下垂体の前葉を持ち上げます。白色光源を組織に向けます。脳を予冷したステンレス鋼ブロックに置き、氷冷生理食塩水に氷で囲んでブロックを冷たく保ちます。
構造を保存するために、氷冷食塩水で組織を定期的に湿らせます。大脳皮質が上を向くように脳を配置します。小さな湾曲した鉗子を使用して、小脳を取り除きます。
背側アプローチを使用して、小さな湾曲した鉗子の閉じたブレードを脳梁の下に滑り込ませ、それを穏やかに広げて新皮質を両側に引っ込め、非常に顕著な正中線のランドマークを保存します。最終的には、視交叉、視床下部、嗅球、延髄、下垂体ストック、橋橋などの構造が見えます。半球を分離してみてください。
脳の腹側部位を上にひっくり返し、大脳半球の嗅球の間の背側から矢状中央の切り込みを入れます。髄質を取り除き、2つの半球を静かに分離します。次に、池の内側の縁に冠状に切り込みを入れて後脳を取得し、池の後縁で髄質を分離します。
2つの大脳半球を注意深く分離するために脳組織を反転させます。このステップで嗅球を取り外します。脳梁の属の1ミリメートル前方に冠状動脈を切断し、副嗅球を取り除き、続いて内側と外側の前頭前野を分離します。
側脳室の前角の下の正中線から前交連の横方向部分を水平または冠状に部分的に切断し、中隔核を背側に、腹側線条体を腹側に解放する。側側面から少量の皮質を取り除き、屈生核と嗅結節を取り除きます。線条体の吻側部分を、外部カプセルのすぐ外側にカットされた湾曲したメスを介して、上にある皮質から分離します。
中隔核または中隔を特定し、このセクションから分離します。このステップで視床下部を分離するために湾曲したカットを作成します。これは、乳頭体の後方にある部分的な冠状切断を使用して行われます 視床下部溝まで横方向にのみ伸びています。
次に、視床下部溝の長さに沿って傍矢状カットで視床下部の断面を解放します。側脳室をエバートして、残りの大脳辺縁系コンポーネントに追加の辺縁系接続を明らかにします。内皮質の内側部分では、心室を開いた後に扇状構造が観察される。
嗅内皮質の扇状構造を使用して解剖用の縁を定義し、扁桃体、嗅内皮質、後帯状皮質、海馬を特定して除去します。正中線吻側皮質面に延びる背側表面の髄脈を可視化することで視床の識別を確認します。冠状動脈切断によって視床を中脳から完全に分離する。
このプロトコルは、頭蓋骨から脳を即座に除去し、その後解剖するために使用できます。解剖された組織は、研究の要件に応じて保存し、後で処理することができます。複数の解剖組織から抽出されたRNAは、遺伝子発現についてアッセイすることができる。
代表的な結果は、RNA抽出前に摂氏マイナス80度で数ヶ月間保存された収穫された脳を使用して得られた。PTSDの侵略者曝露社会的ストレスモデルの下で、体重データとともに異なる脳領域が収集された。RNA濃度と分光光度測定値がここに示されています。
このプロトコルに従うときは、脳を氷のスチールブロックに保ち、定期的に組織に氷の生理食塩水をまき散らすことで、組織が常に冷えていることを確認してください。組織を採取してすぐに凍結すると、後でトランスクリプトミクス、メタボロミクス、プロテオミクスなどのアッセイに使用できます。
