このプロトコルは、異なるVigilin状態における電気コルチコチコの調節における特定の個々の分子標的の役割を同定するために使用することができる。アデノ関連ウイルスを使用することの利点の中には、特定の脳領域および特定の細胞タイプを正確に標的にする能力がある。このプロトコルのデモンストレーションは、私のチームの研究員であるジュリアン・デュフォート=ジェルヴァイスです。
麻酔を受けた12週齢のマウスでつま先ピンチ反射に対する応答の欠如を確認した後、ヘアトリマーを使用して、耳の後ろから目の前に髪を剃ります。脱水症状を防ぐために各目に眼軟膏の寛大な滴を加え、耳の棒を使用してマウスの頭部をステレオタックス装置に慎重に固定します。口から舌をそっと引っ張り出して窒息を避けます。
マウスの鼻を装置に固定し、70%エタノールを使用して頭部に露出した皮膚を殺菌する。余分なグレイフ鉗子で皮膚を保持し、組織はさみを使用して耳の根元から目のレベルまで皮膚を切断し、切開の両側に2つの外科用クランプを置いて皮膚を伸ばし、頭蓋骨を露出させる。脳の縫合を避け、はさみ先端を使用して頭蓋骨の表面を傷つけて骨膜を取り除き、2つ以上の方向に重なり合う筋を作成します。
骨片を除去し、頭蓋骨を消毒するために70%エタノールを使用してください。以前に用意したカニューレをステレオタクティックアームに固定して、ブレグマとラムダの位置を特定し、それぞれのステレオタキシック座標に注意してください。ステレオタキシックな腕とペンを使用して、頭蓋骨のカニューレの位置を正中線に1.5ミリメートル横に、ブレグマに1.5ミリメートル前部をマークします。
0.7ミリメートルのドリルビットを使用して、頭蓋骨表面に垂直なマークされた位置に頭蓋骨を慎重に突き刺し、垂直軸に合わせて頭蓋骨を洗浄し、10%ベタジンポビドーネ溶液に浸した無菌綿の先端で頭蓋骨を洗い、1マイクロリットルのシリンジのプランジャーを1マイクロリットルで引き込んで1マイクロリットルの気泡でカニューレをロードします。次に、対象とするAAV混合物を遅いピペットと混合し、滅菌ペトリ皿に1.7マイクロリットルの混合物を加えます。この注射器を使用して、溶液の1.5マイクロリットルをカニューレにロードし、接続されたPE50チューブ上の気泡の位置をマークします。
カニューレが骨の上端に達し、頭蓋骨表面のZ座標をマークできるように、カニューレを頭蓋骨の穴に垂直に合わせます。先端が頭蓋骨表面と運動皮質の層5の下1.5ミリメートルに達するまでカニューレをゆっくりと下げ、シリンジポンプを毎分0.025マイクロリットルの流量で始動し、40分にわたって1マイクロリットルのAAVを送達します。チューブ内の気泡を使用して、必要に応じて調整を行い、射出を追跡します。
ウイルスの全容が送達されたら、カニューレを5分間所定の位置に置いて、十分な拡散を確保し、ゆっくりと慎重に立ち上げて皮質からカニューレを取り除く前に逆流を避ける。電極注入の場合、ストレート・ケリー・鉗子を使用して、AAVが注入された穴の垂直軸にストレートゴールドワイヤーを持つ1つの電気コルチコチコ図電極をゆっくりとねじ込み、頭蓋骨の外に少なくとも2.5ミリメートルのネジを残して、硬膜および大脳皮質の損傷を最小限に抑えます。ペンを使用して、参照電極の位置を正線に右に2.6ミリメートル、後部0.7ミリメートルの位置をブレグマに、後心電図電極の位置を正線に右1.5ミリメートル、λに1.5ミリメートルの前部および左半球の3つのメンテナンスネジの位置を特定の座標なしでマークします。 しかし、お互いから、そして電気コルチコサイト電極から可能な限り遠く離れています。
ドリルを使用して、他の電極とネジの印の位置で頭蓋骨表面に垂直な頭蓋骨を慎重に突き刺し、10%ポビドーネ溶液で突き刺さった頭蓋骨を洗います。出血や汚染を防ぐためにネジを取り付ける前に、繊細なタスクワイプの小さなロールピースで穴をブロックし、穴が貫通したのと同じ角度でドリルホールにネジを挿入するためにまっすぐなケリー鉗子を使用します。ネジの中のリングのようなスペースの中央に歯科用セメントの小さな滴を置き、首の筋肉の上の皮膚を持ち上げるために余分な細かいグレイフ鉗子を使用します。
デュモン番号5鉗子を使用して、1つの筋電図電極の湾曲した四肢を保持し、筋肉に約1〜2ミリメートル挿入します。電極の湾曲した側と折り畳み点を歯科用セメントに配置し、2つ目の筋電図電極を同様に挿入します。動物の目を覆った後、セメントを固めるために3〜5分間光を当て、追加の歯科用セメントを使用して、電気コルチコチコ形状電極のベースとアンカースクリューを覆い、クラウン型の輪郭を形成します。
さらに3分から5分の光を塗った後、モンタージュの中心をアクリルセメントで満たし、外科用クランプを取り外します。合成吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して、モンタージュの前面と背面の皮膚を閉じ、頭蓋骨が露出しないようにし、曲面鉗子を使用してモンタージュの上のコネクタを保持し、電極の金線をコネクタピンに慎重に整列させ、各電極の端部を対応する単一のコネクタピンに素早くくすんだ。マウスをフレームから取り外した後、コネクタとヘッドの間の空きスペースをアクリルセメントで覆います。
そして、計量した後、ヒートパッドにメッシュされていない蓋をしたきれいなケージにマウスを置きます。手術の2週間後、マウスを記録ケーブルに接続し、少なくとも1週間後に、24時間以上の電気コルチコグラフィーおよび筋電図信号を記録する。感染が成功した場合、注射部位を取り巻く運動皮質内のニューロンのHA染色により、コフィリンS3D HAの存在を示す。興奮性ニューロンマーカーCaMKIIαとの共染色は、高倍率下での透明なコフィリンS3D HAおよびCaMKIIアルファ共発現を示す。
覚醒、遅い波の睡眠、および逆説的な睡眠のためのログ変換された相対的なパワースペクトルは、コフィリン不活性化の下でスペクトル活性の状態固有の違いを示す。精密な分子標的の電気コルチコグラフィー記録とAAV媒介操作の組み合わせは、複数の脳領域や、睡眠に加えててんかんや記憶に関する研究などの他の神経科学のサブ分野にも適用できます。
