この作品は、ALS 協会、Karyopharm ・ セラピューティクス社、Meira GTx、感謝しております、トーマス ・ ローソンから ALS 研究慈善寄付によって賄われていた。アドバイスやトレーニング、エリスの果樹園とドナ バーニーに感謝します。JAS が嘘をついた財団によって支えられたし、健康の国民の協会は GM103418 を付与します。

すべてのプロシージャ適切な NIH ガイドラインに従った。すべてのプロシージャは続く動物愛護とシュリーブ ポートにルイジアナ州立大学健康科学センターで使用の委員会によって承認された動物のプロトコルです。この手順で使用された 6 週齢の雌ラット。
 1 です。 必要なベクトルの用量/ボリュームを決定する <ol><li>ラットに注入すると、各動物に必要なウイルスのベクトルの量を決定するベクトル準備の力価 (集中) に基づく計量。以前ラット中枢神経系における効率的な表現に成功しているベクトルの用量を使用 (ジャクソン ら を参照してください 。6). 注: AAV9 TDP-43 または AAV9 GFP、典型的な線量は 3 x 10 13 - 1 x 10 14 ベクトル ゲノム/kg の間。6 週齢の若いラットの重さ約 150 g.</li>
	<li>は、体系的な比較のためのすべての動物の 1 kg あたり等価線量です。ボリュームは標準的なお勧めの注入量 (250 グラムのラットの 250-500 μ L) を超えないことを確認します。典型的な注入量は若いラットに 200 μ l.</li>
</ol> 2。作業ステーションを準備する <ol><li>すべての必要な消耗品を収集: ピペット先端およびマイクロ ピペット動物、動物、ガーゼ (1 頭につき 2-3) あたり 1 つのアルコール準備パッドあたり正方形 (約 5 x 5 cm) の 1 つのパラフィン フィルム</li>。
	<li>は、70% エタノールで表面をクリーニングして作業面を準備します。ダウン (~ 37 ° C) の低に設定温度に加熱パッドを配置します。加熱パッドの上にベンチのパッドを配置します</li>。
	<li>は、ガス麻酔 (イソフルラン) を準備します。十分な酸素とガス麻酔の手順を確認します。70% エタノール誘導商工会議所と麻酔マスクをきれいにし、ベンチのパッドに麻酔マスクを配置します</li>。
</ol> 3。ベクターの準備 <ol><li>室温でベクトルを解凍し、各動物のための 1 つの滅菌遠心チューブのラベルします</li>。
	<li>ピペット AAV のボリュームで決定適切なチューブに 1.1 をステップし、必要な注入量 (ここでは、200 μ l) までボリュームを持って一日リンガー &#39; s ソリューションまたは生理食塩水</li>。
	<li>パルス渦 1 〜 2 秒のためのサンプルとしてパルス 5 遠心管の底に、サンプルを持参して s</li>。
	<li>チューブとパラフィン膜の角にラットの総注入量をピペットで移しなさい</li>。
	<li>1 mL シリンジに 30 ゲージ針を配置します</li>。
	<li>パラフィン フィルムのベクターに下向き傾斜面と針の場所。すべてのウイルスは、針と注射器までシリンジのプランジャーを戻るに引き抜きます。練習すれば簡単になる針の中に空気の泡を描画を避けるために注意してください</li>。
</ol> 4。ラットを準備 <ol><li>1 L/min まで酸素を切りイソフルラン麻酔を 5% に設定します。すべての接続ホースとバルブの向きを確認して誘導室にガス麻酔が流れることを確認します</li>。
	<li>ラットが応答するまで、ガス麻酔誘導室約 3 分でラットを配置します</li>。
	<li>は、つま先をつまんで麻酔の十分な深さを確保します。つま先ピンチ後足または脚の運動ができません</li>。
	<li>イソフルラン麻酔を麻酔の維持のための 2% に削減し、麻酔は麻酔マスクに流れているので、活栓を調整します</li>。
	<li>ラットの場所 &#39; s 麻酔マスクの鼻、それがその側に横たわっているラットを調整します</li>。
	<li>外側尾静脈を識別します 。
	注: 外側尾静脈約 10 と 2 o にある &#39; 12 尾の背の上部に時計 o &#39; 時計。その側に横たわっているラット、外側尾静脈中に直面する必要があります</li>
	<li>は、アルコール パッドで準備注入領域を拭いてください。注射部位は尾の長さを 3 分の 2 です</li>。
</ol> 5。ベクトルを注入 <ol><li>をしっかり尾わずか 1 本指による注入領域の上外側尾静脈経由で直接; これは静脈を拡張します</li>。
	<li>ベベル上向き、同じ方向に見える尾静脈針を合わせます</li>。
	<li>しっぽを押さえて尾静脈を押すと他の手を避けるために偉大な世話ながら尾静脈を皮膚を突き刺し</li>。
	<li>通常血流を許可するように尾静脈からの圧力を解放します</li>。
	<li>は、静脈に針を移動します。針は尾静脈を穿刺するように、少し引きプランジャー。針が静脈の血液が針に流れます。
	<ol><li>針必要に応じて位置を変更します。その後、針を安定させるために注射部位の下に注射部位の上で手を動かすし、尾に対して注射器の端を保持します</li>。
	</ol></li> <li>尾 (約 20 μ L/s) にベクトルをゆっくり挿入します 。
	注: 静脈は、ベクトルの流れるとして色を失う可能性があります。ソリューションが外静脈注入された標識は、ブレブ、ベクトルを注入すると、皮膚、または抵抗のブランチングします。練習では、余分な血管の露出を最小限に抑えることができます</li>。
	<li>ベクターを投与されている後、ラットから針を除去し 30-60 の出血を止めるために注射部位に対してガーゼのパッドを押す</li>
</ol> 6。クリーンアップ <ol><li>オフ、イソフルレン麻酔と酸素。それが意識を取り戻すまでにラットを監視し、そのケージに戻します</li>。
	<li>は、シャープス コンテナーのすべての針を慎重に配置します。可能性のある適切なバイオハザード容器に AAV で汚染されている他のすべてのディスポーザブル材料の処分します。70% エタノール ワーキング ステーションをきれいします</li>。
</ol> 7。後肢エスケープ反射を評価 注: 後肢欠損が生じますベクター投与量に応じて、TDP 43 遺伝子導入後 2 ~ 6 週間。
<ol><li>の破片の平らな面クリアで 2 本の指でつかむラット &#39; s 本体から約 2 cm の尾します。前肢は、ラットの腹部の下側を見ながらぶら下がっているまでにラットをそっと持ち上げます。
	<ol><li>遺伝子導入後の実験経過を通じて毎週プロシージャを実行 (例えば、遺伝子導入後 12 週間まで). 
		注: もこの方法で前肢の赤字をスコアが、後肢欠損は使用されるベクトル量によっては、このモデルで発生する可能性が高いです</li>。
	</ol></li> <li>、10 時に正中線に向かって 1 つまたは両方の後肢を握り締める場合 10 s. メモのため、後肢を観察 s.</li>
	<li>繰り返しこのテストは 30 で 3 回の合計 s トライアルの間。1 つまたは両方の後肢は、3 つの試験のそれぞれの clenched は、ラットは、運動機能障害を示しています。一貫性のあるすべての 3 つの試験で食いしばりがある場合、現在どちらかの片側または両側の後肢の赤字 (ノート) で手動でデータを記録します</li>。
</ol> 8。Rotarod の運動機能を評価 <ol><li>、rotarod を設定する、rotarod の下にあるベンチのパッドを配置し、(~0.3 回転/秒で速度増加) が 2 分間かけて 4 40 回転/分 (rpm) に加速度を設定します。12 週間の時間コース 2、4、8、被験者を実行し、遺伝子の後 12 週間転送します</li>。
	<li>を許可します。20 分テスト部屋に順応するラット</li>
	最初に、rotarod を使用して、まず 4 rpm のスピードで rotarod を起動し、rotarod のラットを配置するラットを訓練するには、<li>。徒歩で 4 回転、1 回転してから加速を開始ラットとそれが落ちるまで、rotarod の上を歩くラットを許可します。ラット 40 少なくとも一貫して歩くことができるまでトレーニングを続ける s。この方法で健康な若いラットに容易に訓練されます。
	<ol><li>顕著な運動障害があるラットの場合、40 の落下にベースライン遅延を達成するからラットを防ぐことができますを s、ラット rotarod 得点を開始する前に 3-5 トレーニングの試みを提供します</li>。
	</ol></li> <li>Rotarod テストを開始する、rotarod のラットを配置し、rotarod の加速を開始。ラットが rotarod; から落ちる時間に注意してください。これは、秋に待ち時間です。ラットは、120 の後、rotarod に残っている場合 s、この時点でのセッションをキャップ、rotarod からラットを削除、120 の秋の遅延時間を記録 s.</li>
	<li>は、3 つの試験の合計 2 回のテストを繰り返します。疲労の影響を最小限に抑えるために離れて試験、少なくとも 5 分をスペースします。3 つの試験の点数の平均値します。健常者のラットは典型的にはの落下に平均待機時間 &#62; 40 s.</li>
	<li>ケージに戻ってラットを置き、rotarod と周辺地域の 70% エタノールをきれいします</li>。
</ol> 9。小脳における GFP 発現定量化 <ol><li>ラットを麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) とし、4% パラホルムアルデヒドを灌流します。脳と脊髄の解剖し、組織を固定液に一晩浸して、30% ショ糖液に移動します。平衡後、カット ステージ 4 , 5 , 6 を凍結との滑走式ミクロトームで 50 μ m のコロナ セクション</li>。
	<li>は、小脳虫部、小脳の中央の葉には等間隔に配置する小脳の 3-6 セクションを選択します。信号を最大化する GFP の蛍光ラベルします。1: 500 で GFP の一次抗体を使用し、1: 300 4 , 5 , 6 の希釈でアレクサ 488 共役二次抗体を使用します 。
	注: を参照してください 4 , 5 , 6 サンプリングの詳細についてを参照、ステイニングします</li>。
	<li>は、顕微鏡を用いた低倍率レンズで興味の定義された領域内の各セクションを photomicrograph します。使用 2.5 × 対物 (エヌ 0.12) とフィルター設定 10、450-490/515-565 励起/蛍光)。カメラの設定のまま (露出時間、例えば、2 s) 分析するサンプルを横切って同じです。として保存します。TIF ファイル</li>。
	<li>は、広く利用可能なサイオン イメージ プログラムで顕微鏡写真を開く; 2 つのウィンドウが開きます。閉じるウィンドウとして示される &#34; インデック スカラー &#34;.</li>
	<li>選択 &#34; オプション &#34;、その後 &#34; 密度 SliceŔ 色合いの範囲はルックアップ テーブル (LUT) ウィンドウで赤色に表示されます。ウィンドウで特定 GFP ラベルのみを入力するカーソルを使用し、非固有の背景画像でピックアップを開始したときを停止します 。
	注: これを定量化する顕微鏡に蛍光の領域を強調表示します。設定は、具体的にはのすべての目に見えない蛍光セルをキャプチャする最適化必要があります。練習では、このメソッドは正確に特定の蛍光を強調します</li>。
	<li>蛍光領域を測定する前にまず正しい単位 (ピクセル) でテストの測定がされるように。これを行うには、クリックして &#34; 分析 &#34;、その後 &#34; セット ScaleŔ4 行目が言う必要があります &#34; 単位 &#34;。ドロップ ダウン リストから選択をクリックしてピクセル単位で測定するためのピクセル &#34; [ok] &#34;。解析オプションを切り替える &#34; 含めるインテリア穴 &#34; 分析のセルの体全体を含めることを確保するためです</li>。
	蛍光の面積を測定する <li>をクリックして &#34; 分析 &#34; し &#34; メジャー &#34;。この値を表示するをクリックして &#34; 分析 &#34; をクリックして &#34; ショー ResultsŔ結果ウィンドウが表示されます。というラベルの見出しの下での蛍光の面積測定になります &#34; エリア &#34;.</li>
	<li>の測定の間で標準化するように、LUT の] ウィンドウで強調表示されている値を変更しないでください</li>。
	<li>すべての測定値が記録されている、かつては平均各動物 (動物あたり 3-6 節) からの値です。適切な統計テストを使用すると、グループ間導入されたエリアを比較します。 6</li></ol>

<ol>
	<li>Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons.">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injections+in+neonatal+mice.">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansive+gene+transfer+in+the+rat+CNS+rapidly+produces+amyotrophic+lateral+sclerosis+relevant+sequelae+when+TDP-43+is+overexpressed.">Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed.</a> Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).</li><li>Dayton, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+forelimb+impairment+in+rats+expressing+a+pathological+TDP-43+25+kDa+C-terminal+fragment+to+mimic+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9+supports+wide-scale+transduction+of+the+CNS+and+TDP-43+disease+modeling+in+adult+rats.">AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats.</a> Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).</li><li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+targeting,+better+efficiency+for+wide-scale+neuronal+transduction+with+the+synapsin+promoter+and+AAV-PHP.B.">Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B.</a> Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).</li><li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+respiratory+changes+at+end+stage+in+a+FUS-induced+disease+state+in+adult+rats.">Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice.">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+vector+&amp;#34;magic+bullet&amp;#34;:+targeted+expression+in+the+central+nervous+system+after+peripheral+delivery+using+the+synapsin+promoter.">Gene vector &amp;#34;magic bullet&amp;#34;: targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).</li><li>van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+embolism:+pathophysiology+and+treatment.">Gas embolism: pathophysiology and treatment.</a> Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).</li></ol>

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AAV ベクターの様々 な配送ルートをテストされている: イントラ実質、内 cerebroventricular、内莢膜、静脈内、鼻腔内、筋肉内、等。各ルートは、特定の利点と欠点があります。成人ラット AAV の尾静脈投与は中枢神経系の一貫性のある情報伝達を実現するための信頼性の高い方法です。末梢注入方法注入カニューレの中枢神経組織への導入を回避、低侵襲。このメソッドによって達成することが...

組換えアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターでは、あまり生体内でのニューロンの伝達効率がよく、中枢神経系研究のための不可欠なツールです。AAV のベクトルが異なる遺伝子とタンパク質アイソ フォーム、さまざまな組織、別のホスト種、および管理の別の路線を勉強のため非常に汎用性。周辺は、比較的非侵襲、ニューロン中枢神経系全体を最初に変換する静脈注射の記載・ フォウストらとドゥケらによってマウスに AAV を管理ことができますたとえば、(を参照してくださいゼウス紙 Gombash et al.(2014 年))。1,2,3この遺伝子配信アプローチをどちらかの緑色蛍光タンパク質 (GFP) を効率的に表現するラットの使用または ALS 関連タンパク, transactive 応答 43 kDa (TDP-43) 中枢神経系の DNA 結合タンパク質。4,5,6,7,8,9ラットでの作業は、ラットの代謝および生理学的パラメーターはマウスと比べて人間に近い、行動および毒性学的試金のラットのために特別に設計されていますので重要です。さらより多くの遺伝子組み換えラット線が可能になっている AAV 遺伝子伝達研究で利用可能します。
メソッドは、ラットと成果の迅速で信頼性の高い定量広大な中枢神経系遺伝子伝達の詳細です。大規模な中枢神経系の情報伝達は、TDP 43 脊髄全体に表現することによってラットの ALS の症状を模倣する使用されます。メソッドが使用されるジャクソンら若いラットに TDP 43 ベクトルの尾静脈注射6,8,2 つの方法で獲得した TDP 43 による運動障害が数週間後、 9 : 反射と rotarod と、デイトンら・ ジャクソンらとエスケープ5,6,7,9制御 GFP ベクトル、事後分析での小脳の蛍光の面積はジャクソンらにおいて伝達効率の指標として計算は6,8小脳の解析周辺遺伝子デリバリー後中枢神経系伝達性の迅速かつ信頼性の高いインデックスをあると証明したし、さまざまな周辺機器、中央へ遺伝子導入を試みるアプローチを適用する必要があります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Pelouze</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bucket</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12014000</td>
			<td>4000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#39;s Solution</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>0338-0114-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>128101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22624415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td>Comes with a 25g needle attached. 
			Replace with 27-30g needle for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>66794-013-25</td>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia mask</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-2524</td>
			<td>2&#34; x 2&#34; (5cm x 5cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>4642080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia vaporizer</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td>4214322</td>
			<td>Classic T3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia scavenger</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td>32373B10</td>
			<td>Enviro-PURE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sears</td>
			<td>17280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56617-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotarod</td>
			<td>Panlab/Harvard Apparatus</td>
			<td>76-0772</td>
			<td>4 rats/ 4 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2401</td>
			<td>140 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89108-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scion Image</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td>Primary Antibody - 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary Antibody - 1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 40 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction

アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターでは、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR)、オプトジェネティクス、cre lox ターゲットなどをクラスター化、神経科学の主試薬です。本稿の目的は、AAV の尾静脈注射を介してラットにおける広大な中枢神経系 (CNS) 遺伝子導入を試みている調査官を支援するためにです。広範な病理学の条件に関連する大規模な式をその大きいサイズとマウスと比較された人間に生理学的な類似性のため重要なラット モデル。この例のアプリケーションでは、大規模な神経伝達を使用して、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、脊髄全体に影響を与える神経変性疾患を模倣します。効率的な大規模な中枢神経系の情報伝達は、前臨床試験で治療上の蛋白質の要因を提供する使用できます。数週間の後注入式間隔の後、伝達の効果が評価されます。緑色蛍光タンパク質 (GFP) の制御ベクトルの小脳の GFP の量は基本的なイメージング プログラムによって、迅速かつ確実に推定されます。ALS によって誘導される運動疾患表現型関連タンパク質 transactive 応答 43 kDa (TDP-43) の DNA 結合タンパク質は、赤字脱出反射と rotarod で獲得しています。疾患モデル作製、遺伝子治療以外に、ここで説明した大規模な遺伝子ターゲットの潜在的な用途があります。このメソッドの利用拡大は、神経科学と川和で仮説を迅速に役立ちます。

TDP 43 誘導運動障害が生じれば、AAV tdp-43 使用 (図 1) 投与量に応じて 2-6 週間以内。部分的にまたはない障害; 失敗した尾静脈注射になりますAAV の効果血流に到達する必要があります。AAV GFP の成功した射出脳と脊髄を通じて GFP 発現ベクター投与量依存的になります。ドライブ式に、サイトメガロ ウイルスの鶏 β アクチン ハイブリッド プロモー...

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Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

methods-tips-for-intravenous-administration-adeno-associated-virus-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K ビュー.  Louisiana State University Health Sciences Center. ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。

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Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

齧歯類モデルで中枢神経系の疾患を治療するための全身および局所薬物送達

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

神経科学

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

マウスモデルにおける静脈内自己投与方法

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

幹細胞由来の中枢神経系ニューロンのネットワーク化培養における生物学的神経毒の機能評価

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. Using subpially-placed polyethylene catheters (PE-10 or PE-5) for AAV9 delivery, potent transgene expression through the spinal parenchyma (white and gray matter) in subpially-injected spinal segments has been demonstrated. Because of the wide range of transgenic mouse models of neurodegenerative diseases, there is a strong desire for the development of a potent central nervous system (CNS)-targeted vector delivery technique in adult mice. Accordingly, the present study describes the development of a spinal subpial vector delivery device and technique to permit safe and effective spinal AAV9 delivery in adult C57BL/6J mice. In spinally immobilized and anesthetized mice, the pia mater (cervical 1 and lumbar 1-2 spinal segmental level) was incised with a sharp 34 G needle using an XYZ manipulator. A second XYZ manipulator was then used to advance a blunt 36G needle into the lumbar and/or cervical subpial space. The AAV9 vector (3-5 &#181;L; 1.2 x 1013 genome copies (gc)) encoding green fluorescent protein (GFP) was then injected subpially. After injections, neurological function (motor and sensory) was assessed periodically, and animals were perfusion-fixed 14 days after AAV9 delivery with 4% paraformaldehyde. Analysis of horizontal or transverse spinal cord sections showed transgene expression throughout the entire spinal cord, in both gray and white matter. In addition, intense retrogradely-mediated GFP expression was seen in the descending motor axons and neurons in the motor cortex, nucleus ruber, and formatio reticularis. No neurological dysfunction was noted in any animals. These data show that the subpial vector delivery technique can successfully be used in adult mice, without causing procedure-related spinal cord injury, and is associated with highly potent transgene expression throughout the spinal neuraxis.

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

The goal of the present study was to develop and validate the potency and safety of spinal adeno-associated virus 9 (AAV9)-mediated gene delivery by using a novel subpial gene delivery technique in adult mice.

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

メソッドおよびアデノ随伴ウイルスラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

要約

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齧歯類モデルで中枢神経系の疾患を治療するための全身および局所薬物送達

マウスモデルにおける静脈内自己投与方法

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

の中枢神経系における単一細胞のラベリング

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

幹細胞由来の中枢神経系ニューロンのネットワーク化培養における生物学的神経毒の機能評価

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

要約

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齧歯類モデルで中枢神経系の疾患を治療するための全身および局所薬物送達

マウスモデルにおける静脈内自己投与方法

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

の中枢神経系における単一細胞のラベリング

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

幹細胞由来の中枢神経系ニューロンのネットワーク化培養における生物学的神経毒の機能評価

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

メソッドおよびアデノ随伴ウイルスラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント