Name: utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
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1. 酵母総抽出物の調製
<ol><li>1 L YNB-glu培地(酵母窒素基底に2%m/vグルコースを補充)のTAPタグ9 に融合したスプライシング因子の1つを発現する酵母細胞を、適切なアミノ酸または核塩基で増殖させ、 この場合、アデニン(20μg/mL)、ロイシン(30μg/mL)、トリプトファン(30μg/mL)、OD600= 1.0まで。</li>
	<li>1L培養から細胞を1L培養から採取し、4°Cで10分間17,000xgの3本の500mL遠心分離器ボトルで遠心し、10mL冷たい滅菌水で2回洗浄します。 </li>
	<li>採取した酵母細胞をコールドバッファーAの細胞体積の1/10に再懸濁させる(10 mmolL-1 HEPES pH = 7.9,1.5 mmolL-1 MgCl2,50mmolL-1 KCl,5%v/vグリセロール,0.5 mmol L-1 DTT,EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル)。</li>
	<li>液体窒素中の細胞懸濁液の小さな滴を凍結します。小さな滴は、再懸濁された細胞溶液をピペット化し、50 μLを液体窒素に直接滴下することによって得ることができる。 注意:液体窒素は皮膚や目と接触して傷害を引き起こす可能性があります。適切な安全装置を使用して取り扱います。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。細胞懸濁液の凍結滴は-80°Cで保存することができる。</li>
	<li>ボールミル装置で20 Hz/sで6サイクル3分間粉砕して、酵母細胞のライセートを調製します。 注:各サイクルの後、凍結した細胞を含む容器を液体窒素に浸して、溶融を避けてください。プロトコルはここで一時停止することができます。凍結した抽出物は、-80°Cで保存することができる。 酵母スプライシング抽出物は、ホモジナイザーを用いて、スフェロプラスト10をリセートしたり、乳鉢および害虫11,12を使用して調製することもできる。</li>
	<li>それを含むチューブを室温で水に入れ、時折揺れ動かして抽出物を溶かします。</li>
	<li>遠心分離機抽出物は4°Cで1時間45,000xgで抽出する。 </li>
	<li>BCA法13によりクリアされた上澄みのタンパク質含有量を定量化する。</li>
	<li>抽出物のアリコートを準備し、液体窒素で速く凍結し、-80°Cで保存します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>2. グリセロール勾配製剤
<ol><li>バッファーAに2つのグリセロール溶液を調製し、1つは10%v/vを含み、もう1つは30%v/vグリセロールを含みます。</li>
	<li>30%v/vグリセロール溶液中に0.1%v/vに架橋剤グルタルアルデヒドを加え、均質化するために混合する。 注意:適切な安全装置を使用して、ヒュームフード内のグルタルアルデヒドを取り扱います。</li>
	<li>12 mL 遠心管の底部に冷10%v/vグリセロール溶液(14 x 89 mm)を加えます。</li>
	<li>10%v/vグリセロール溶液のすぐ下に、チューブの底にグラジマスターデバイスを備えた長い針に付着した注射器を備えたグルタルアルデヒドを添加した冷たい30%v/vグリセロール溶液の6 mLを加えます。 注:または、10%v/vグリセロール溶液は、30%v/vグリセロール/グルタルアルデヒド溶液の上部に慎重にパイプすることができます。</li>
	<li>グラデーションマスターデバイスを使用して、連続した密度勾配を生成します。 注:勾配マスターデバイスでは、チューブは適切なラックに配置され、パラメータ(時間/角度/速度)を決定するためのメーカーの推奨事項に従って、短時間回転されます。この作業では、2:25分/81.5°/11rpmを使用しました。</li>
	<li>細胞抽出物を添加する直前に、7%v/vグリセロール/バッファーAクッションを200 μL慎重に加えます。 注:クッションのグリセロール濃度は、線形勾配を作成するために使用されるあまり濃縮されたグリセロール溶液よりも低くなければなりません。</li>
</ol>3. 遠心分離を抽出する
<ol><li>各12 mLリニアグリセロール勾配10%~30%のグルタルアルデヒドの上部に、合計タンパク質の約2mgをクッション付きでロードします。</li>
	<li>チューブをあらかじめ冷却されたスイングバケットローターに入れ。 メモ:超遠心分離の前に混合を避けるために、チューブを穏やかに処理します。</li>
	<li>遠心分離機 194,000 x g で 16 時間 4 °C.</li>
	<li>アリコート 24 500 μL フラクションで、適合した Econo システムを使用するか、慎重にピペット処理を行います。 注:適合Econoシステムは、蠕動ポンプ、UV検出器、チューブ穿光装置に接続された分数コレクターで構成されています。沈み込みプロファイルは、280 nmでの吸光度の測定によって監視することができます。</li>
	<li>ペリスタリポンプを通して40%v/vグリセロール溶液を使用して、グリセロールをチューブから分画コレクターに10%~30%の勾配で押し込みます。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。分数は使用するまで-80°Cで保管してください。</li>
	<li>ドットブロットまたはスロットブロットデバイス上のニトロセルロース膜に直接各画分の50 μLをロードします。2次抗体としてCBPに対する抗体(1:6,000、TAPタグのCBP部分を検出する)と抗ウサギIgG(1:15,000)を併用してタンパク質を検出した。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., L&#252;hrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes.">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).</li><li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome.">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).</li><li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases.">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li><li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy.">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li><li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li><li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p/Cef1p,+novel+pre-mRNA+splicing+factors,+and+snRNAs.">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li><li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes.">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract.">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li><li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3'+splice+site+selection.">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes &amp; Development. 9, 855-868 (1995).</li><li>Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+whole+cell+splicing+extract.">Preparation of yeast whole cell splicing extract.</a> Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).</li><li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents.">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li><li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast.">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li><li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mRNA+splicing+in+vitro.">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li></ol>

著者は利益相反を持っていません。

タンパク質とリボ核酸-タンパク質相互作用は、架橋剤を使用して安定化することができます。得られた複合体は、グリセロール勾配に対する超遠心化に耐える安定であることが重要である。さらに、バッファー条件では、相互作用を許可する必要がありますが、非特異的なバインドを回避するのに十分な厳格な必要があります。ここに示す実験では、インビトロスプライシング反応15に対して既に確立されている緩衝溶液を用いた。
遠心分離の速度と時間は、解析される複合体に合わせて最適化する必要があります。我々は、同様の結果で、94,000 x g で遠心サンプルと194,000 x g の16 hで異なる沈み込み条件をテストしました。これらのコントロールは、解析対象の複合体が沈殿しない条件を決定するために重要です。
また、ドットブロットがより再現性の高い結果を与えたことを示したスロットブロットまたはドットブロットシステムを使用して、膜上で直接ピペット化する異なるブロット法をテストしました。
クロスリンカーとしてグルタルアルデヒドを使用する主な制限は、架橋を元に戻すことができないということです。したがって、タンパク質はSDS-PAGEの後の免疫ブロットでは分析できませんが、ネイティブゲルまたはドットブロットによってのみ分析されます。しかし、ホルムアルデヒドなどの可逆的架橋剤も使用される可能性がある。
我々は以前、タンパク質の共免疫沈降を用いてスプライシング複合体を同定したが、一過性または弱い相互作用の場合、架橋は後で質量分析によるその成分の決定のために中間複合体の単離に役立つかもしれない。ここでの焦点は spliceosome でしたが、この方法は、さまざまな組成を持つ中間複合体を含む他の動的プロセスの分離に確実に使用できます。

スプライシングは、多数の因子の結合と解放を必要とする非常に動的なプロセスです。これらのスプライシング因子は、RNA結合タンパク質、ATPAses、ヘリカーゼ、タンパク質キナーゼおよびホスファターゼ、ユビキチンリガーゼ、とりわけ1、2、3を含む。また、分子の再調整を可能にするために、これらの要因のいくつかは、スプライセソームサブコンプレックスに非常に一時的に結合し、これらのRNP中間複合体の単離および同定を非常に困難にする。
ここでは、Grafix法4,5を使用して、酵母スプライシング因子Cwc24とBアクトコンプレックス6との相互作用を安定させ、そのサブ複合体に付随して結合する他の因子を同定し、ユビキチンリガーゼPrp19がCwc24の結合または放出に何らかの役割を果たしているかどうかを判断しました。場所。グリセロール勾配に沿って架橋剤の濃度を増加させる高分子を暴露する利点は、複合体間架橋4、5、したがって、凝集体の形成を回避することです。
この方法は、タンパク質共免疫沈降およびプルダウンアッセイの補完として使用されたが、これは、大きな複合体の単離を可能にするにもかかわらず、大きな動的複合体7,8内の一過性相互作用を維持するために信頼できない可能性がある。グリセロール勾配における固定化試薬の使用は、このような因子の結合を安定化させ、特定のタンパク質とスプライシングサブコンプレックスとの相互作用を確認することを可能にする。選択した架橋剤は化学的に不可逆的であったため、回収された画分に存在するタンパク質を、勾配遠心分離後のドットブロットで分析した。

<table><tbody><tr><td>Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope</td><td>Millipore</td><td>07-482</td><td></td></tr><tr><td>ECL anti-Rabbit IgG</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td></td></tr><tr><td>EconoSystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1-800-424-6723</td><td>Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector</td></tr><tr><td>EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Fraction Recovery System</td><td>Beckman Coulter</td><td>270-331580</td><td>Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem</td></tr><tr><td>Gradient Master Model 107ip</td><td>Biocomp</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Mill MM 200</td><td>Retsch</td><td>207460001</td><td>Ball Mill device</td></tr><tr><td>Rotor F12-6x500Lex</td><td>Thermo Scientific</td><td>096-062375</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>36-101-0816</td><td></td></tr><tr><td>Swinging Bucket Rotor P40ST</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge CP 80 NX</td><td>Hitachi</td><td>901069</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr></tbody></table>

utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes

プレmRNAスプライシングは、組立、RNA処理、および複合成分の放出中に、多くの分子再構成を伴う非常に動的なプロセスです。グリセリン勾配遠心分離は、機能および構造研究のためのタンパク質またはRNP(RiboNucleoProtein)複合体の分離のために使用されています。ここでは、単一粒子の凍結電子顕微鏡用の高分子複合体を精製・安定化するために最初に開発されたGrafix(勾配固定)の利用について述べ、一過性のスプライセソー複合体と結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。この方法は、複合体を安定化させる固定化試薬の濃度の増加にサンプルの遠心分離に基づいています。グリセロール勾配にロードされた酵母総抽出物の遠心分離後、回収された分率は、個々のスプライシング因子の存在の決定およびスプライセソームサブ複合体の同定のためにドットブロットによって分析される。

Cwc24-TAPの沈殿プロファイルを解析し、グラフィックス法がスプライシングサブコンプレックスへの結合を安定化するのに有効であったかどうかを判断するために、Cwc24-TAPを発現する細胞の全酵母抽出物を、クロスリンク剤としてのグルタルアルデヒドの存在下または存在下にグリセロール勾配に遠心分離して分離した。24個の500 μL画分のサンプルを、次に、TAPタグのCBP部分に対する抗体を用いてスロットブロットで分析した。結果は、架橋器の不在時に、Cwc24が分数5と13(図1B)の間に集中し、約80〜200MDa14の複合体に対応することを示す。しかし、架橋器の存在下では、グラデーション上のCwc24の位置は、より大きな複合体に対応するグラデーションの下部の分数にシフトされる(図1)。これらの結果は、グルタルアルデヒドがCwc24とスプライシング複合体との関連を安定化させることを示す。
Cwc24を保持する複合体が、SnRNPs U2、U5、およびU6およびNTC複合体によって形成されるBact複合体に対応しているかどうかを確立するために、Cwc24沈殿をU5 snRNPサブユニットPrp8およびNTCサブユニットPrp19のタンパク質を発現するタンパク質の1つにそれらを比較した。 続いて、タンパク質の検出のためのドットブロットが続きます。これら3つのスプライオサムサブユニットは、グラデーションの下部に大きな複合体を有する堆積物、同様のプロファイルを示した。Cwc24は同じ分数に集中しているが、一過性にスプライセソームと関連付けるため、より軽い分数にも存在する(図2)。ドットの定量化は、これらのプロファイルを示しています (図 2B)。
興味深いことに、分数11と12はPrp8とPrp19が集中し始めるものであり、これがBact複合体が沈み始める勾配の部分であることを示唆している。これらのタンパク質がこれらの画分中の複合体に結合していることを確認するために、分画11および12のアリコートは、天然ゲル上の電気泳動を行い、その後ウェスタンブロットに供した。Prp8とPrp19のシグナルは、8%のアクリルアミドゲルに入るのがやっとのスミアとして現れ、それらが実際に大きな複合体の一部であることを示しています(図3)。Cwc24は画分12にも存在するが、はるかに低い濃度では、Bact複合体へのその過渡的結合と一致する。これらの結果は、グルタルアルデヒドが架橋剤として使用され、亜複合体のスプライシングへの過渡的因子の結合を安定化できることを示している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61994/61994fig01.jpg"> 図1:グラフィックスは、より大きな複合体に関連するCwc24を保持する。Cwc24-TAPを発現する細胞の全酵母抽出物は、架橋体グルタルアルデヒドの存在下または存在下のいずれかでグリセロール勾配上で遠心分離により分離した。(A)勾配の奇数分数は、TAPタグのCBP部分に対する抗体を有するCwc24-TAPの免疫検出のためにスロットブロットを施した。(B)画像Jを用いたCwc24-TAPの定量化は、グリセロール勾配の画分を通してタンパク質の濃度を示す。グルタルアルデヒドの有無が示される。Y軸は、Cwc24の勾配を通る相対量を示し、第1の分数(F n/F1)に対する、端数における信号の強度として計算する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61994/61994fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61994/61994fig02.jpg"> 図2:グリセロール/グルタルアルデヒド勾配によるスプライシング因子の沈殿Cwc24、Prp8、またはPrp19のいずれかを発現する酵母細胞の抽出物は、スプライシング複合体の分離のためにグルタルアルデヒドおよび遠心分離を含むグリセロール勾配にロードされた。(A)24画分の勾配のサンプルを、TAPタグのCBP部分に対する抗体を用いたTAP融合タンパク質のドットブロットおよび免疫検出によって分析した。(B)画像Jを用いたタンパク質の定量化は、グリセロール/グルタルアルデヒド勾配の下端での濃度を示す。Y軸は、グラディエントを通るタンパク質の相対量を示し、画分におけるシグナルの強度として計算し、背景上のシグナルを示す第1分に対して(Fn/F1)を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61994/61994fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61994/61994fig03.jpg"> 図3:ネイティブPAGEおよびイムノブロットによるスプライシング複合体の検出。図2に示す勾配の画分11および12のアリコートは、8%アクリルアミド天然ゲル上の電気泳動によって分離され、CBPに対する抗体を有するイムノブロットに供された。タンパク質は、複合体が大きすぎてネイティブゲル上で分離できないため、バンドとして検出されません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61994/61994fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

ここでは、架橋器の存在下でのグリセロール勾配遠心分離であるグラフィックス(勾配固定)の利用について、一過性にスプライセソーム複合体に結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。

サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

utilization-grafix-for-detection-transient-interactors-saccharomyces

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

3.5K ビュー.  University of Sao Paulo. ここでは、架橋器の存在下でのグリセロール勾配遠心分離であるグラフィックス(勾配固定)の利用について、一過性にスプライセソーム複合体に結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

遺伝学

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

生物学

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. Whether disease-related or functionally selected, many of these mutations have been studied using growth assays in the model organism Saccharomyces cerevisiae (yeast). The splicing-specific copper growth assay, or ACT1-CUP1 assay, provides a comprehensive analysis of mutation at the phenotypic level. The ACT1-CUP1 assay utilizes reporters that confer copper tolerance when correctly spliced. Thus, in the presence of copper, changes in yeast viability correlate to changes in mRNA production through splicing. In a typical experiment, the yeast spliceosome is challenged with different non-consensus splicing reporters and the splicing factor mutation of interest to detect any synergetic or antithetical impact on splicing. Here a full description of copper plate preparation, plating of yeast cells, and data evaluation are given. A selection of complimentary experiments is described, highlighting the versatility of the ACT1-CUP1 reporters. The ACT1-CUP1 assay is a handy tool in the splicing toolbox thanks to the direct read-out of mutational effect(s) and the comparative possibilities from the continuing use in the field.

The ACT1-CUP1 assay, a copper growth assay, provides a quick readout of precursor messenger RNA (pre-mRNA) splicing and the impact mutant splicing factors have on spliceosomal function. This study provides a protocol and highlights the customization possible to address the splicing question of interest.

ACT1-CUP1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by homologous recombination (HR). In addition, HR represents an important mechanism of replication fork rescue following stalling or collapse. The regulation of the many reversible and irreversible steps of this complex pathway promotes its fidelity. The physical analysis of the recombination intermediates formed during HR enables the characterization of these controls by various nucleoprotein factors and their interactors. Though there are well-established methods to assay specific events and intermediates in the recombination pathway, the detection of D-loop formation and extension, two critical steps in this pathway, has proved challenging until recently. Here, efficient methods for detecting key events in the HR pathway, namely DNA double-stranded break formation, D-loop formation, D-loop extension, and the formation of products via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae are described. These assays detect their relevant recombination intermediates and products with high sensitivity and are independent of cellular viability. The detection of D-loops, D-loop extension, and the BIR product is based on proximity ligation. Together, these assays allow for the study of the kinetics of HR at the population level to finely address the functions of HR proteins and regulators at significant steps in the pathway.

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

The D-loop capture (DLC) and D-loop extension (DLE) assays utilize the principle of proximity ligation together with quantitative PCR to quantify D-loop formation, D-loop extension, and product formation at the site of an inducible double-stranded break in Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of galectin-3 into the splicing pathway is addressed in this paper. Sedimentation of HeLa cell nuclear extracts on 12%-32% glycerol gradients yields fractions enriched in an endogenous ~10S particle that contains galectin-3 and U1 snRNP. We now describe a protocol to deplete nuclear extracts of U1 snRNP with concomitant loss of splicing activity. Splicing activity in the U1-depleted extract can be reconstituted by the galectin-3 - U1 snRNP particle trapped on agarose beads covalently coupled with anti-galectin-3 antibodies. The results indicate that the galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternary complex is a functional E complex leading to intermediates and products of the splicing reaction and that galectin-3 enters the splicing pathway through its association with U1 snRNP. The scheme of using complexes affinity- or immuno-selected on beads to reconstitute splicing activity in extracts depleted of a specific splicing factor may be generally applicable to other systems.

This article describes the experimental procedures for (a) depletion of U1 snRNP from nuclear extracts, with concomitant loss of splicing activity; and (b) reconstitution of splicing activity in the U1-depleted extract by galectin-3 - U1 snRNP particles bound to beads covalently coupled with anti-galectin-3 antibodies.

ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

生化学

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded cellular environment. Ribosomes provide the platform for spatially and kinetically controlled binding of membrane-targeting factors, modifying enzymes, and folding chaperones. Even the assembly into high-order oligomeric complexes, as well as protein-protein network formation steps, were recently discovered to be coordinated with synthesis.
Here, we describe Selective Ribosome Profiling, a method developed to capture co-translational interactions in vivo. We will detail the various affinity purification steps required for capturing ribosome-nascent-chain complexes together with co-translational interactors, as well as the mRNA extraction, size exclusion, reverse transcription, deep-sequencing, and big-data analysis steps, required to decipher co-translational interactions in near-codon resolution.

Co-translational interactions play a crucial role in nascent-chain modifications, targeting, folding, and assembly pathways. Here, we describe Selective Ribosome Profiling, a method for in vivo, direct analysis of these interactions in the model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用

要約

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単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

分裂酵母分裂酵母のディープシーケンスアシスト、自発的な抑制画面

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

ACT1-CUP1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速なインビボ固定と分離

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用

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単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

ACT1-CUP1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

分裂酵母分裂酵母のディープシーケンスアシスト、自発的な抑制画面

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速なインビボ固定と分離