このプロトコルは、分裂酵母の成長欠陥を有する変異体のサプレッサー突然変異を同定するための、単純で効果的なサプレッサースクリーンを記述する。従来の突然変異誘発法は、細胞内に複数の変異を発生させることができる有毒な化学物質またはUVを使用する。逆に、このプロトコルは、変異誘導法を用いることなく、個々の細胞における単一のサプレッサー変異体を濃縮することができる。
テキスト プロトコルで説明されているように、ひずみの構築と準備を行い、この手順を開始します。96ウェルのポリスチレンマイクロプレートの各ウェルに200マイクロリットルの液体培地を加えます。滅菌アプリケーターを使用して、調製されたコロニーのそれぞれを少量取り、液体培地を含む個々の井戸で各コロニーを中断する。
同じ媒体の200マイクロリットルを含むプレート上のすべての行のためのブランクウェルを含める。今度は、自動マイクロプレートリーダーに接続されたプレートリーダー検出ソフトウェアにプロトコルを設定します。温度を摂氏30度に設定し、2分の読み取り頻度で24時間運動プログラムを設定します。
これにより、井戸あたり24時間にわたる合計読み取り時間は721件になります。連続的な速い軌道振に揺れを設定します。光読取を設定して、600ナノメートルの波長で光散乱を測定し、光密度を測定し、プレートの下から読み取る光を設定します。
24時間後、最終的な空の光密度測定値を記録し、テキストプロトコルの式を使用して、各サンプルを0.1の光学密度に希釈するのに必要な量を決定します。各実験井戸から使用する希釈量をバッチ処理するには、プレートリーダーソフトウェアからデータをエクスポートし、関数と同じ式を挿入するスプレッドシートソフトウェアを使用します。24時間ごとに、ゼロ日と同じ培地を使用して、各サンプルを式を使用して0.1の光学密度に希釈します。
すべてのウェルを0.1の光学密度まで希釈するために、必ず式を使用してください。これには、成長欠陥の回復を示し始めた可能性のある井戸が含まれます。毎日生成されたすべての成長曲線を保存します。
同じ遺伝的背景を有するコホートの残りの部分よりも有意に高い最終的な光学密度または野生型コロニーと類似した成長曲線によって判断される成長速度の増加を示す個々のコロニーに注意してください。このアッセイは通常、約7〜14日かかります。滅菌条件下ですべてのステップを実行します。
プレートリーダーアッセイの最終日から、一部の液体培養物は、親の突然変異の表現型を緩和できるサプレッサー突然変異を得ることによって、顕著に回復した増殖速度を有すると考える。平種的に回収した培養物を保存するために、250マイクロリットルの液体培養液を、50%グリセロールの250マイクロリットルを含むクライオチューブに移し、混合する。フラッシュは液体窒素で細胞を凍結し、マイナス80°Cで無期限に株を保存します。
サプレッサー変異が遺伝的に遺伝性の要素であることを確認するには、標準的な遺伝的交差法を使用して、お気に入りの変異体P細胞を好きな変異体S細胞と交差させます。無料の交配タイプを持つ2つのハプロイド細胞が混合され、窒素飢餓にさらされると、4つの胞子の四面体を形成するために胞子を生成することができます。親の遺伝物質は、メンデリア遺伝学の規則に従って、meiosの間に分離されます。
胞子形成後、同じ四面体からの個々の胞子を解剖し、プレート上で垂直に観察されるように4つの個々のコロニーを形成することができる。マイクロニードルを使用して、プレート上に胞子を一つずつ均等に置きます。解剖後、コロニーが現れるまで、細胞を30°Cの培養器で数日間成長させます。
サプレッサー突然変異が遺伝的に遺伝性の要素である場合、この十字架は、2つのコロニーが親株の病気表現型を有し、2つのコロニーがサプレッサー株の回復増殖率を有する四面体を生じるべきである。同じ遺伝的十字架からサプレッサー表現型と親の表現型を持つ3つのコロニーを選び、テキストプロトコルで詳述されているようにゲノムDNA抽出とシーケンシングステップを進めます。次に、テキストに詳述されているようにサプレッサー突然変異の同定のためのバイオインフォマティクス分析を行う。
個々のコロニーの成長曲線は、プレートリーダーを用いた連続モニタリングを用いて、初期時点および6日間に記録した。予想通り、野生型コロニーは実験を通して成長曲線に顕著な変化を示さない。特に、elf1欠失の背景と1つのfal1欠失コロニーを持つ4つのコロニーは、成長の遅い成長から野生型コロニーと同様の成長の様々なレベルへの成長の劇的な変化を示しています。
劇的に、すべてのclr6変異体は、アッセイの終わりまでにより速い速度で成長する一貫した表現型の回復を示す。同定された非同義的変化のうちの2つは、cue2突然変異およびrpl2702突然変異を、部位指向突然変異の標準的なプロトコルを使用して実験室で再構成された。Cue2 elf1二重変異体およびrpl2702 elf1二重変異体は、無料のelf1欠失変異株と交配した。
遺伝子交差は、同定されたサプレッサー突然変異がelf1欠失変異体の成長が遅い表現型を抑制することに成功し、遺伝性であることを示した。96ウェルプレートの毎日の希釈時には、人工的な成長回復を避けるために、すべてのウェルを同じ濃度に希釈することが重要です。この方法は、高スループットでサプレッサー突然変異の単離を可能にし、分裂酵母および他の微生物において十分に特徴づけられていない何百もの遺伝子の発見をスピードアップする。
この方法は、成長欠陥を引き起こす突然変異を有し、液体培養中の大規模な集団に成長することができるすべての微生物のサプレッサーを分離するために使用することができる。分裂酵母のサプレッサー突然変異を同定することは、特に酵母からヒトへの高度に保存された経路に関しては、重なり合う経路で病気を引き起こす遺伝子を見つけるのに潜在的な影響を及ぼす可能性があります。
