このプロトコルは、様々な研究および細胞ベースの治療アプリケーションのために生体分子を効率的に送達できるアクロス流体系の組み立てと操作を記述する。このシステムの主な利点は、生体分子を細胞に迅速に送達し、その生存率を維持できることです。がん治療など、さまざまな細胞治療用途に細胞を形質転換できるプラットフォーム技術です。
カップにPDMSベースの54グラムと治癒剤の6グラムを組み合わせることから始めます。少なくとも1分間、ヘラと激しく十分に混ぜ合わせ、約30分間、または残気泡が取り除かれるまで、PDMS溶液を付けたカップをデシケータに入れます。150ミリメートルのペトリ皿に上向きのパターンを持つフォトレジストコーティングウエハースを置き、次にPDMS溶液を金型の上に注ぎます。
必要に応じて、ペトリ皿をデシケータの中に入れ、残された気泡が消えるまで真空を適用します。ペトリ皿をラボオーブンに移し、60°Cで2時間焼いてPDMSを治します。硬化後、ウエハの端をカミソリの刃で切り取って、ペトリ皿からPDMSを慎重に取り除きます。
ナイフまたはカミソリの刃を使用して個々のデバイスを切り取り、2.5ミリメートルの生検パンチを使用して入口と出口ポートに穴を開けます。PDMSデバイスを酸素プラズマで処理した後、すぐに各デバイスをガラス表面に向けたチャネルを備えたきれいなソーダライムガラス顕微鏡スライドに置きます。デバイスが室温で一晩接着できるようにします。
直径1~2ミリメートルの直径1センチメートルのピエゾトランスデューサーの表面にシリコーンをそっと塗布し、その後、トランスデューサを同心渦巻きに慎重に合わせ、ガラス顕微鏡スライドの底にそっと押し付けます。USB AからBのケーブルを使用して、マイクロコントローラをコンピュータに接続します。緑色の電源LEDインジケータが点灯するはずです。
コンピュータ上の関連ソフトウェアを使用して、8メガヘルツ信号を生成するプログラムをアップロードします。PZT トランスデューサの各ワイヤの端に 1 インチ 22 ゲージ ワイヤをはんだ付けします。次に、それを使用して、PZTトランスデューサのマイナス端子線をGNDピンに接続します。
PZTトランスデューサの正の端子線をはんだ付きワイヤーを介して出力ピンに接続します。タイゴンPVCソフトプラスチックチューブの3〜6インチのセクションをカットし、入口と出口ポートにチューブを押します。開口部に収まるまで圧力をかけながらチューブを回転させる必要があるかもしれません。
必要に応じて、接着は、PDMS とチューブを結合するために接合部で適用することができます。オプションで、アヌースト流体デバイスとマイクロコントローラを3Dプリントケースに取り付けます。メーカーの指示に従ってマイクロ流体貯留層を組み立てます。
1/16インチ内径タイゴンPVCソフトプラスチックチューブの3〜6インチのセクションをカットし、マイクロ流体貯留層の出力から1/32インチ内径チューブの上に押し込みます。必要に応じて、漏れを防ぐためにパラフィンフィルムで接合部を包みます。マイクロ流体貯留層の側面に周囲の空気で60ミリリットルのシリンジを充填します。
シリンジポンプを1時間あたり200ミリリットルの速度に設定し、1時間あたり50ミリリットルの体積流量でアクロ流体デバイスを介して造影剤溶液を押し出し、デバイスの出力から50ミリリットルの遠心分離管にサンプルを収集します。25ミリグラムのDSPC、11.6ミリグラムのDSEPC、0.26ミリグラムのDSPG、および0.88ミリグラムのポリオキシエチレン40ステアリン酸を加えることによって、20ミリリットルのシンチレーションバイアルでリン脂質溶液を調製します。すべてのリン脂質が溶解するまでクロロホルムを加えます。
乾燥剤でクロロホルムを48時間蒸発させて、乾燥した脂質膜を形成する。10ミリリットルの無菌PBSで泡を水分補給し、40%振幅で3分間脂質溶液を超音波処理してカチオンミセル溶液を形成する。超音波処理後、リン脂質溶液は摂氏2~6度で最大1ヶ月間保存できます。
超音波造影剤を調製するには、2ミリリットルガラス中隔バイアルに滅菌PBSの600マイクロリットルにカチオンミセル溶液の200マイクロリットルを追加します。キャップを圧着してバイアルを密封します。1.5インチ20ゲージ針を使用して、バイアルヘッドスペースにデカフルオロブタンガスを30秒間充填します。
バイアルをアマルガメートしてパーフルオロブタンガス充填超音波造影剤を形成する。細胞溶液1ミリリットルあたり超音波造影剤溶液の25マイクロリットルを追加します。次に、直ちにアヨス流体装置を介して結合された造影剤と細胞混合物をポンプで送り出す。
このプロトコルは、複数の細胞株における細胞内分子送達を高めるために使用できるアキュトー流体系を生成する。蛍光化合物の細胞内送達は、フルオレセイン、一次ヒトT細胞への、未治療対照群と比較してアヌースト流体処理により改善された。T細胞の蛍光強度は治療後5倍に増加し、フルオレセインの送達が増強されたことを示す。
細胞生存率は、アソ流体処理後にわずかに減少したが、未治療の対照群の単独および細胞へのフローと比較して、ヒトA549肺癌細胞への防腐化合物トレハロースの細胞内送達を増強した80%アコウスト流体治療を強化した。カチ素マイクロバブルを細胞溶液に追加することが重要です。生体分子の細胞内送達は、カチオンマイクロバブルを溶液に入れずに制限されます。
このプラットフォームは、様々な生体分子の細胞内送達を可能にし、研究や治療目的のために細胞機能を変化させる可能性があります。この手順を完了した後、追加の細胞特性評価を行い、様々な生体分子を送達する影響を評価することができます。
