我々はシステム、マイクロ流体デバイスの設計上のアドバイスやセットアップの機械加工部品のハーバード大学のロー​​ランド研究所のスタッフのためのジョシュアエデルの開発に彼の助けのためにチャンドラSabanayagamに感謝。我々は、有用な情報については、UIUCで便利ローランド研究所とボストン大学のメラーのグループのメンバーとのディスカッション、そしてT.ハのグループのメンバーを認識する。最後に、我々は、国立科学財団（PHY - 0701207）と国立衛生研究所（GM075893）から財政支援に感謝。

1 - マイクロ流体セルの組み立てマイクロセルを融合させることにより行われる模様の、新鮮な洗浄石英カバースリップに厚さ2mm、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ディスク。 PDMSのディスクには、バッファの制御フローについては、それぞれ、バッファのリザーバーとシリンジポンプに接続されている入口と出口柔軟な毛細血管によってアクセスされる4つの30μlの長方形のチャンバーが含まれています。フローセルは、ガラス窓で、その裏側でサポートして温度を調節する熱電素子冷却水を含むカスタムメイドのセルホルダーに配置されます。 <ol><li>パターニングされたPDMSディスク、1部硬化剤と混合し10重量部のシリコーンエラストマーの基盤を作るために、よく混合し、真空中で1時間脱気したままにします。 </li><li>ゆっくりとマイクロセルの金型上にエラストマーミックスを注ぐ。私たちのケースでは、これは、ネガ型フォトレジストから作られたfourストリップ（1 × 4 × 1 × 3 ×300μm以下）1&quot;シリコンウェハである。70℃のホットプレート上で治すためにこれを残す℃で2時間。 </li><li>慎重にカミソリの刃を使用して金型から硬化PDMSのディスク皮。 30秒間の両方の表面を酸化してプラズマ1 &#39;&#39;ガラス窓（チャネルの両端に8 × 2mmの直径プレドリル穴を含む）の上にディスクを融合。 PDMSのディスク（チャネルを含んでいない側）の平らな側面にガラス窓を融合。 </li><li>それはチャンネルに達するまで、各ガラスの窓の穴から2インチの長いフレキシブルフューズドシリカキャピラリーチューブを挿入します。第一針を挿入し、毛細管と続くのは、このプロセスを容易にすることができる。クイックキャストのような高速硬化型シリコーン鋳造の化合物を使用してガラス窓の穴を密封する。 </li><li>エタノールと水でチャンネルをすすぎ、30秒たての洗浄、1インチの円形の石英カバースリップと一緒に細胞をプラズマが非アクティブにする。私たちは、ピラニアを使用して、このカバーガラスを清掃示唆している*.チャンバーを密閉する、チャネルを含むセルの側面にカバースリップを融合。 </li><li>室温で一晩硬化させるために組み立てられたセルのままにします。 </li></ol> *ピラニアは、H 2 O 2とH 1:2.5の比率で2 SO 4のソリューションです。カバーガラスをクリーニングするには、90ピラニアでそれらを浸す℃で20分間。 2 - 分子の固定化のために表面をアクティブにする核酸の研究については、最も単純な表面固定化スキームは、最初にコーティングのガラスまたはビオチン化ウシ血清アルブミン（BSA）とその後ストレプトアビジンとを有する石英カバースリップをされています。これにより、ビオチン化サンプルは室温で日間高い特異性で固定化することができます。 <ol><li>注射器と針を使って簡単にバッファの注入のために毛細血管にフレキシブルチューブを接続します。 </li><li> 0.1バッファのビオチン化BSAのmg / mlの液を注入（10mMトリス- HCl、pH8.0の、50mMのNaClは、0.02μmのフィルターを使用してフィルタ処理された）、少なくとも30分間チャネルとインキュベートに。 </li><li>バッファの流れ300から500μlを、チャンバー内の気泡をトラップするように注意しながら、チャンネルから任意の空きビオチン化BSAを除去する。 </li><li>バッファ内のストレプトアビジンの0.1 mg / mlの液を注入し、15分間インキュベートする。次に、ステップ3を繰り返します。 </li><li>ビオチン化サンプルの3-5 pmのソリューションを介して流れ。蛍光分子のカバレッジをチェックするために表面スキャンを実行します。必要に応じて、より良いカバレッジを取得するサンプルの濃度を増加させる。 10分間インキュベートし、ステップ3を繰り返します。 </li></ol>マイクロセルは光学的に符号化されたDCモータを使用して粗（最大25 mm）の動きを可能にする電動XYステージに搭載された、と細かい（1 nm）の動き二つクローズドループピエゾアクチュエータを使用している（Physik InstrumenteモデルM - 014または類似の）。これは、前またはサンプルの固定化のための表面を活性化後に行うことができます。 3 - イメージングバッファ（IB）を準備 IBは、酵素的酸素掃気システムや、トロロックスのような三重項消光剤、から構成されています。 IBは常に一晩を通してフラッシュされるので、少なくとも10 mlを事前に準備する必要があります。 <ol><li> 0.8パーセントw / vのD -グルコースを10ml、少なくとも35 mMのトリス- HCl pH 8.0にし、脱イオン水のNaCl 50mMのを準備します。バッファの高濃度は、2つの理由から重要です：溶解トロロックスは、ソリューションを酸性化し、酵素反応は、また時間をかけて溶液のpHが低下します。このソリューションは、長い貯蔵寿命を持っているので、それは、原液として保存することができます。 </li><li>数分間ボルテックスしてから、&gt; 10分間振とうすることにより、ステップ1で調製した緩衝液中でトロロックスの5mgを溶解する。トロロックスは、pH&gt; 7で水に溶けにくいので、このステップを急がせることはありません。 0.2μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングし、10分間真空下で脱ガスしておきます。 </li><li> 60μlの瓦を混合することにより、&quot;gloxy&quot;酵素溶液を調製R、5X緩衝液20μl、カタラーゼ、1mgのグルコースオキシダーゼおよび10 mg / mlのBSAを100μl、20μlの。 0.22μmの遠心フィルターを使用してソリューションをフィルタリングする。 </li><li>ゆっくりと気泡の形成を回避手順3から&quot;gloxy&quot;ソリューションでステップ2からバッファを混ぜる。 </li><li>流量を制御する機械式シリンジポンプを使用して、5μl/分の一定速度でチャンネルを介してIBが流れます。バッファーに再溶解から大気中の酸素を防止するためにIBの貯水池にバブルアルゴンガス。 </li></ol>表面スキャン、単一分子の強度のトレースの分子の局在や買収は、自動データ収集1を許可するLabVIEWプログラムによって制御されます。プログラムは、0.1μm/秒の速度で、0.2μmの解像度で20 × 20μmの2つのエリアをスキャンします。データはすぐにバックグラウンドカウント上記の全ての画素の輝度加重の位置を得るために処理されます。固定化分子が発見されれば、それらは共焦点体積中に一つずつ移動され、ドナーとアクセプターフルオロフォアの強度は、両方の蛍光体の光退色するまでの時間の関数として記録されます。ステージは、100μmの離れて新たな原点に移動するようにプログラムされ、スキャンプロセスが繰り返されます。 4 - 代表的な結果下記の表面活性化の前と分子の固定化の準備ができて顕微鏡にマウントされた後、組み立てられたマイクロセルを示すいくつかの画像があります。チャネルが正常にアクティベートされている場合は、表面のスキャンが直接ドナーの励起後にドナー色素（緑）とアクセプター（赤）の発光を示す下図のスキャンのようになります。これらの分子は、プローブのボリュームに一つずつ移動され、単一分子のトレースに示すように蛍光が、両方の染料の光退色するまで時間をかけて記録されます。これらのような痕跡から順番に生物学的興味の分子の構造とダイナミクスを探求するために使用される瞬間的なドナー - アクセプター分離、上知らせるFRETの効率を得ることができます。 <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" /> 図1：4つのチャンネルを持つマイクロ流体セル、入口/出口毛細血管それぞれ。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="図2" border="0" /> 図2：測定の準備ができて顕微鏡に搭載されたセル。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="図3" border="0" /> 図3：SM - FRETの測定のセットアップ。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">ここをクリックして</a>図3の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="図4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="図5" border="0" /> 図4および図5：固定化の表面のスキャンの赤と緑のチャンネルは、緑色のレーザーで励起分子のFRET。大きいのバージョンを確認するにはクリックしてください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">図4</a> 、または<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">図5</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="図6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="図7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="図8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="図9" border="0" /> 図6、7、8、9：ドナーの強度の軌跡（緑）とDNA分子8、10、16と離れて18塩基対に標識された受容体（赤色）蛍光体。の拡大バージョンを確認するためにクリックしてください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">図6</a> 、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">図7</a> 、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">図8</a> 、または<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">図9</a> 。

<ol>
	<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Techniques,+a+Laboratory+Manual.">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis.">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules:+Corrections+due+to+nonideal+transfer.">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li><li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Article in preparation. , .</li></ol>

上記のプロトコルは、私たちの特定のシステムのために、染料（TMRとATTO647N）の特定の選択のための最適化されていますが、それは決して唯一の証明方法を意味することです。最近、プロトカテク酸（PCA）/ protocatechuate -3,4 -ジオキシゲナーゼ（PCD）で構成される代替酸素掃気システムは、特定の染料4の光安定性を向上させることが示された。これらは特定のCy5で5に、いくつかの色素の点滅長期的な抑制されない場合がありますが、同様に、このようなβ-メルカプトエタノール（BME）のような他の三重項状態の消光剤は、トロロックスの代わりに使用できます。 （BSA）ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン化ウシ血清アルブミンを介して固定化核酸の研究のための好ましい選択肢ですが、それが非特異的接着1をしなくなるため、ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされた表面は、より良いタンパク質の研究に適しています。さらに、サブ回折限界サイズの小胞は、それが表面の相互作用6によって影響を受けることができる場合に関心の生体分子をカプセル化するために使用することができます。 この記事では、蛍光強度のトレースを取得するためにシリコンアバランシェフォトダイオードを搭載した共焦点セットアップを使用している。このプロトコルは、CCDカメラを搭載した全反射蛍光顕微鏡（全反射）でも同様に動作します。に関係なく使用される顕微鏡の、SM - FRETドナーとアクセプターの信号が適切に7を修正されると、オングストロームに近づいて空間分解能で通知することができます。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>TSP150375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Esco Products</td>
<td>R425000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diba Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9085</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>0021122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DowCorning</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>238813</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose Oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Cast Sealant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>Kwik-Cast</td>
<td>Silicone Casting Compound</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）顕微鏡は、広くそのような核酸やタンパク質などの生物学的興味の分子の構造とダイナミクスを研究するために使用されています。単一分子が（SM - FRET）FRETを固定化した分子の測定は、両方の色素が分にミリ秒から時間スケールの広い範囲での生体分子のダイナミクスを報告する、時間トレースに退色-生じるまで、効率よくシステムの長期観測を許可する。統計分析にトレースの多数の買収を容易にするために、プロセスを自動化する必要があり、サンプルの環境をしっかりと全測定時間（〜12時間）で制御することがあります。これは、一晩、単一分子の数千人の尋問を可能にする自動化された走査型共焦点顕微鏡、および制限された酸素含有量を、バッファの制御された交換を可能にし、全体の測定期間を通じて一定温度を維持するマイクロセルを使用して行われます。ここでは、マイクロ流体デバイスを組み立てるための方法およびDNA固定化のためにその表面を活性化する方法を示します。その後、我々は、フルオロフォアの光安定と寿命を最大化するためにバッファを準備する方法について説明します。最後に、我々は時間分解単一分子の自動収集のためのセットアップの準備に必要な手順は、DNA分子の痕跡をFRETを示す。

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Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

この記事では、我々は、自動走査型共焦点顕微鏡を用いて表面に固定化された個々のDNA分子からのトレースをFRETの取得方法について説明します。

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K ビュー.  Boston University. この記事では、我々は、自動走査型共焦点顕微鏡を用いて表面に固定化された個々のDNA分子からのトレースをFRETの取得方法について説明します。

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Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

二層弾性特性の変化をモニタリングするための単一分子法

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

生物学

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

核輸送の1分子イメージング

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

1分子FRETによるDNAループを研究

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

自動化された蛍光寿命イメージング顕微鏡を利用してオープンソースのハイコンテンツな解析

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

分離とクラミドモナス由来の単一粒子再構成のための蛍光イメージング

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing the innate cellular fluorescence signature from each individual live cell in a population distributed in a three-dimensional (3D) space. The innate fluorescence signature of a cell is a collection of fluorescence signals emitted by various biomolecules within the cell. Previous studies established that innate fluorescence signatures reflect various cellular properties and differences in physiological status and are a rich source of information for cell characterization and identification. Innate fluorescence signatures have been traditionally analyzed at the population level, necessitating a clonal culture, but not at the single-cell level. CRIF is particularly suitable for studies that require 3D resolution and/or selective extraction of fluorescence signals from individual cells. Because the fluorescence signature is an innate property of a cell, CRIF is also suitable for tag-free prediction of the type and/or physiological status of intact and single cells. This method may be a powerful tool for streamlined cell analysis, where the phenotype of each single cell in a heterogenous population can be directly assessed by its autofluorescence signature under a microscope without cell tagging.

Here, a protocol is presented for optically extracting and cataloging innate cellular fluorescence signatures (i.e., cellular autofluorescence) from every individual live cell distributed in a three-dimensional space. This method is suitable for studying the innate fluorescence signature of diverse biological systems at a single-cell resolution, including cells from bacteria, fungi, yeasts, plants, and animals.

共焦点顕微鏡による単細胞自然蛍光シグネチャの再構築

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

部位特異的DNA切断のための並列高スループット単一分子運動アッセイ

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...