急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

この技術は、モノアミン放出を調べるための一般的に使用される方法の適応であり、一度に複数の薬理学的条件下で予め放射性標識モノアミンを予め取り付けせずに内因性放出の測定を可能にする。この技術の主な利点は、それがかなり費用対効果が高く、複数の薬理学的条件を一度に調べることができ、そして、我々は、静脈とトランスポーター媒介放出を区別する能力を有する内因性モノアミン放出を研究することができるということです。収穫後に成人250から350グラムの雄ラットの脳スライスを調製するために、すぐに脳と氷を冷た酸素化解剖バッファーに置き、対象領域ごとに300ミクロンのコロナ脳切片を獲得した。

脳スライスのさらなる解剖のために、慎重に組織をガラススライドに移動し、ラット脳アトラスを使用して、暗い線条体構造に基づいて裏線条体を識別し、皮質とそのユニークなスパイラル構造への近接性に基づいて海馬を識別する。コントロールスライスと実験スライスとして使用するために、左右半球を分離します。また、後回り線条体をさらに2ミリメートルのパンチに解剖することができる。

次に、修正されたチップを備えたプラスチックトランスファーピペットを使用して、酸素バブリングで酸素化された氷冷解剖バッファーに浸した小さな容器にサンプルを移します。モノアミン放出を誘導するには、一定の穏やかな泡立ちで1ウェルあたり0.5から1ミリリットルの流出バッファーを含む48ウェル流出チャンバーをカスタムメイドの各ウェルに組織サンプルを移し、サンプルが摂氏37度で30〜50分間回復することを可能にする。平衡期間の終わりに、脳組織を含む組織ホルダーを、薬理剤の有無にかかわらず500マイクロリットルの酸素化流出緩衝バッファーを含むウェルに移動し、ウェルの端にあるホルダーをタップして、摂氏37度で20分間のウェル間の緩衝液の最小限の移動を防ぎます。

インキュベーションの最後に、関心のある薬物の有無にかかわらず500マイクロリットルの流出バッファーを含む新しいウェルセットにホルダーを移動し、さらに20分間プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。第2インキュベーション中に、1回のインキュベーションから氷上の1つの正常な過塩素酸またはリン酸の50マイクロリットルを含むマイクロ遠心分離チューブに、第1インキュベーションから溶液を移す。 そしてチューブナンバーワンにラベルを付ける「2回目のインキュベーションの終わりに、組織ホルダーを氷上のプレートと一緒に空の井戸に移動し、上清を2番目のインキュベーションから、通常の過塩素性またはリンの50マイクロリットルを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。氷の上の酸。これらのチューブ番号2にラベルを付ける"上清のすべてが転送されたら、組織の各ウェルに氷冷解離バッファーの1ミリリットルを追加し、各組織サンプルを新しいマイクロ遠心チューブに移すために小さなピンセットを使用します。

サンプルチューブからバッファーを取り出し、組織をマイナス80°Cで保存し、収集したインキュベーション溶液をマイクロ遠心分離用フィルターチューブに移して遠心分離し、HPLC分析まで氷の上に濾液を置きます。ECD と流量の可能性をモノアミンの検出に関するメーカーの推奨に設定します。各サンプルの負荷と適切なアリコートは、自動注入および検出のためのHPLCへの神経伝達物質の標準を含み、測定器が分析を完了することを可能にする。

次に、HPLC解析ソフトウェアを使用して、各モノアミンで構成される標準曲線を使用してクロマトグラフデータを取得および分析し、メーカーのガイドラインに基づいて曲線下の領域を取得します。6時間の機能分析の後、組織サンプルは生存可能であり、1%Triton X-100でインキュベートされたサンプルはMTT変換の有意な減少を示す。アンフェタミンを伴う海馬および前頭前野の脳切片の急性20分治療は、各モノアミンの細胞外レベルの有意な増加を誘発する。

サンプルがフルオキセチン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤で前処理されると、アンフェタミンは海馬内および前頭前野の細胞外セロトニンの増加を誘発し、細胞外ドーパミンおよびノルエピネフリン産生の増加は影響を受けない。さらに、アンフェタミンによるドーサル線条体パンチの急性20分間の治療は、細胞外ドーパミンレベル発現の35倍の増加を誘発し、一方、コカインによるドーサル線条体パンチ治療、モノアミントランスポーターブロッカー、アンフェタミン誘導細胞外ドーパミンの有意な阻害をもたらす。膜脱分極を誘発するために塩化細胞外カリウムの濃度を高めることは、未処理の対照条件と比較してモノアミンの外皮放出を誘導するのに十分であり、フルオキセチンもコカイン処理もこの深い分極化を誘発しない。

クリーンカットセクション、パンチの正確な局在化を持ち、実験全体を通して一貫した酸素化を維持することが不可欠です。脳切片は、ウェスタンブロッティングやヒストロジーなどのさらなる生化学的処理および分析のために実験後に使用することができる。