Cette technique est une adaptation des méthodes couramment utilisées pour examiner la libération de monoamine, permettant la mesure de la libération endogène plutôt que des monoamines radiomarquées préchargées dans plusieurs conditions pharmacologiques à la fois. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est assez rentable, que plusieurs conditions pharmacologiques peuvent être examinées à la fois et que nous pouvons étudier la libération endogène de monoamine avec la capacité de distinguer la libération vésiculeuse de la libération médiée par le transporteur. Pour préparer des tranches de cerveau de rats mâles adultes de 250 à 350 grammes après la récolte, placez immédiatement le cerveau et le tampon de dissection oxygéné glacé et acquérez des sections cérébrales coronales de 300 microns de chaque région d’intérêt.
Pour une dissection plus poussée des tranches de cerveau, déplacez soigneusement les tissus vers des lames de verre et utilisez un atlas du cerveau de rat pour identifier le striatum dorsal en fonction de sa structure striée sombre et pour identifier l’hippocampe en fonction de sa proximité avec le cortex et de sa structure spirale unique. Séparez les hémisphères droit et gauche pour leur utilisation comme tranches de contrôle et expérimentales. Le striatum dorsal peut être disséqué en poinçons de deux millimètres.
Utilisez ensuite une pipette de transfert en plastique avec une pointe modifiée pour transférer les échantillons dans de petits récipients immergés dans un tampon de dissection glacé oxygéné avec bouillonnement d’oxygène. Pour induire la libération de monoamine, transférez les échantillons de tissus dans chaque puits d’une chambre d’efflux de 48 puits faite sur mesure contenant de 0,5 à un millilitre de tampon d’efflux par puits avec un bouillonnement doux constant et laissez les échantillons récupérer pendant 30 à 50 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de la période d’équilibrage, déplacez le porte-tissu avec le tissu cérébral vers des puits contenant 500 microlitres de tampon d’efflux oxygéné avec ou sans agent pharmacologique, en tapotant le support sur le bord du puits pour éviter le transfert minimal de tampon entre les puits pour une incubation de 20 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, déplacez le support vers un nouvel ensemble de puits contenant 500 microlitres de tampon d’efflux avec ou sans le médicament d’intérêt et retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 20 minutes supplémentaires. Au cours de la deuxième incubation, transférer la solution des puits de la première incubation dans des tubes de microcentrifugation contenant 50 microlitres d’un acide perchlorique ou phosphorique normal sur de la glace, et étiqueter les tubes numéro un"À la fin de la deuxième incubation, déplacer le porte-tissu dans des puits vides avec la plaque sur glace et transférer les surnageants de la deuxième incubation vers de nouveaux tubes de microcentrifugation contenant 50 microlitres d’un perchlorique ou phosphorique normal acide sur glace. Étiquetez ces tubes numéro deux"Lorsque tous les surnageants ont été transférés, ajoutez un millilitre de tampon de dissection glacé à chaque puits de tissu et utilisez une petite pince à épiler pour transférer chaque échantillon de tissu dans un nouveau tube de microcentrifugation.
Retirez le tampon des tubes d’échantillonnage et stockez les tissus à moins 80 degrés Celsius, puis transférez les solutions d’incubation collectées dans des tubes filtrants en microcentrifugation pour la centrifugation et placez le filtrat sur de la glace jusqu’à l’analyse CLHP. Réglez le potentiel de l’ECD et le débit sur la recommandation du fabricant pour la détection des monoamines. Charge et aliquote appropriée de chaque échantillon, y compris les étalons de neurotransmetteur dans la CLHP pour l’injection et la détection automatiques et permettent à l’instrument de terminer l’analyse.
Ensuite, utilisez le logiciel d’analyse HPLC pour acquérir et analyser les données de chromatographie à l’aide d’une courbe standard composée de chaque monoamine pour obtenir l’aire sous la courbe en fonction des directives du fabricant. Après six heures d’analyse fonctionnelle, les échantillons de tissus restent viables, tandis que les échantillons incubés avec 1% de Triton X-100 démontrent une réduction significative de la transformation MTT. Le traitement aigu de 20 minutes des sections cérébrales de l’hippocampe et du cortex préfrontal avec des amphétamines induit une augmentation significative du niveau extracellulaire de chaque monoamine.
Lorsque les échantillons sont prétraités avec de la fluoxétine, un inhibiteur sélectif du recaptage de la sérotonine, l’augmentation induite par l’amphétamine de la sérotonine extracellulaire dans l’hippocampe et le cortex préfrontal ne se produit pas, tandis que l’augmentation de la production extracellulaire de dopamine et de noradrénaline n’est pas affectée. En outre, le traitement aigu de 20 minutes des poinçons de striatum dorsal avec de l’amphétamine induit une augmentation de 35 fois de l’expression extracellulaire du niveau de dopamine, tandis que le traitement du punch striatum dorsal avec de la cocaïne, un bloqueur de transporteur de monoamine, entraîne une inhibition significative de la dopamine extracellulaire induite par les amphétamines. L’augmentation de la concentration de chlorure de potassium extracellulaire pour évoquer la dépolarisation membranaire est suffisante pour induire la libération exocytotique de monoamines par rapport aux conditions de contrôle non traitées, et ni la fluoxétine ni le traitement à la cocaïne ne bloquent cette augmentation induite par la polarisation profonde.
Il est impératif d’avoir des sections de coupe propres, une localisation précise des poinçons et de maintenir une oxygénation constante tout au long de l’expérience. Les sections du cerveau peuvent être utilisées après l’expérimentation pour d’autres traitements et analyses biochimiques, tels que le transfert western et l’histologie.
