この技術は、内なる脊髄のチンパニ味経路の重要な部分である、神経細胞性神経節の味に対する神経細胞応答に関する重要な機能的質問に答えることができる。この技術は、動物ごとに記録された細胞が電気生理学的方法を介して典型的に観察されるよりも有意に高いように、単一の実験試験で複数の個々のニューロンのリアルタイム反応を監視するために使用することができる。ヘッドポストに取り付けられたマウスを加熱パッドの上の位置に置いて、胸骨から顎まで、喉の上の皮膚に2センチメートルの正中線切開を行います。
そして、皮膚と上顎下腺を引き込んで、筋の筋肉を完全に露出させます。パラトラチャー筋肉の縫い目を見つけ、鈍い解剖で縫い目を分離し、それを開くために組織を引き込みます。気管の直径の半分以上を切断することなく、ポリエチレンチューブの一部に収まるほどの大きさの気管の上部の開口部を慎重に切断し、チューブを肺に向かって気管に挿入します。
再配置するリアトラクター筋肉を解放し、下顎腺を引っ込める.次に、少量の動物用接着剤を使用して、チューブの上にパラトラクヒールの筋肉を密封します。鼓膜ブラを開くには、望ましい筋を優しく上向きにいじめ、結合組織を引き離します。
血管を避け、筋肉の前端で切開を行います。そして、鼓膜のブラをクリアするまで後に引き戻します。頭を少し後ろに傾けて鼓膜ブラを持ち上げ、頸動脈前部の枝をジガストマッスルの後部挿入点に向けます。
鼓膜ブラの凸構造のためにこの血管の後部にパルパテと筋肉の縫い目を見つける.2組の細かい鉗子を使用して、鼓膜発作の骨が目に見えるまで縫い目で鈍い解剖をし、骨の明確なビューを保つためにリトラクターを使用する。ブラの後部に前部を走る縫い目を見つけ、外科プローブを使用して縫い目の中心の骨に穴を開け、次に、細かい端のはさみのセットを使用して骨の円形領域を切断し、血管の前部および後部をブラの下に切り取らない注意を払う。
原発性を露出させるために、内痛を見つける。内痛の前にテンソルのリンパ筋です。この筋肉を切断し、除去するために春のはさみを使用してください。
外科用プローブを使用して人工内科に穴を開け、すぐに吸引を使用して穴から流れ出る液体を吸引します。内の穴を拡大し、内膜を囲む血管を損傷しないように注意し、後部および横端に。そして、マウスの頭を前方に傾けて、以前の人工内骨構造の下の側頭骨に穴を見つけます。
7番目の神経の上に直接座っている穴に尾根の前部に注意してください。そして、第7の神経を露出させるために側頭骨を慎重に持ち上げることを可能にするために、穴に外科用プローブを挿入します。原発が完全に見えない場合は、動物の頭を緩やかに後ろに傾け、骨の前を神経に引き上げようとします。
神経節がまだ隠されている場合は、より多くの骨を下から引き上げ、骨の下にプローブを深く置かないように注意してください。タスタンパネルを動かすために、吸引して、液をジェラクレート上から取り除き、マウスを解剖顕微鏡の下の吸収パッドの上に置きます。ブラに残された穴、側頭骨の穴、7番目の神経を使用して、神経節の元素を見つけます。
また、蛍光スコープ上のFITCGFPフィルタを使用して、神経節ニューロンを発現する個々のGCaMPを確認します。1つのタスタンラインの分配針を動物の口の中にしっかりと入れ、口の下にペトリ皿を置いて液体を捕まえます。ビデオ録画の開始を、tastant プレゼンテーションの開始と同期し、ライブフィードでの応答、ドリフト、および記録中の浸透を見ます。
もし浸透が起こったら、原発の視野が明確になるまで液体を吸引し、タスタントを再送する。ドリフトが発生した場合は、ヘッドポストのすべての部分がしっかりと締め付けされていることを確認します。応答が発生しない場合は、液体が流れているか、顕微鏡とカメラが視野を隠すことなく適切な位置に焦点を当てているかを確認してください。
すべての所望の実験が完了したら、リトラクタを穏やかに緩和し、動物の反対側の露出とタスタント分析を繰り返します。観察されたように、舌に加えられる味覚刺激は、GCaMP蛍光の急速な一過性増加をもたらし、応答ニューロン間の明るさの顕著な変化を引き起こす。蛍光ビデオ映像の分析は、時間の経過に伴う個々の関心領域内のベースライン応答に対する蛍光の変化に対応する痕跡の生成を可能にする。
閾値レベルを超える蛍光強度の変化は、陽性反応と考えられる。神経節を傷つけることに加えて、出血を避けることが重要です。出血が起こった場合は、生理学と吸引を適用する前に血液が凝固するのを待って、視野から血液を取り除きます。
ジェキラゲンリアの視覚化により、研究者はニューロンの反応を味覚のような刺激に直接測定し、Cre依存性GCaMPなどのツールでこれらのニューロンを同定することができました。
