この方法を使用して監視されるニューロンの数は、古い方法または他の方法では不可能であろうニューロンネットワークデータの収集を可能にする。この技術の主な利点は、後足に加えられた刺激に直接反応して、一度に約2, 000の一次感覚ニューロンを監視できることです。この手順は、末梢性異痛症および疼痛過敏症の治療的介入の研究に特に適しています。
この方法は、三叉神経節または膝状神経節の研究に適合させることができ、またはサイクリックAMPなどの電圧または細胞シグナル伝達分子用の遺伝的にコードされたセンサーとともに使用することができます。この手術を行うには練習が必要です。1匹の動物で最大6つの背側根神経節で練習できます。
手順のデモンストレーションは私自身であり、ジョン・シャノンハウスとルーベン・ゴメス氏の支援を受けます。まず、マウスを加熱パッドの上に置いて体温を摂氏37度に維持します。マウスの骨盤骨を感じて腰椎の肥大を見つけます。
次に、腰椎肥大の領域より上でマウスの背中を剃ります。ハサミを使用して、腰椎の拡大の上に3面の長方形の切開を行い、鉗子で皮膚を折り畳みます。13ミリメートルのスプリング解剖はさみを使用して、脊椎の右側に3〜4ミリメートルの切開を行います。
はさみを使用して皮膚と筋肉を側面に切り戻し、背骨を露出させます。次に、8ミリメートルのはさみを使用して、筋肉と結合組織を切り取り、右側のL5 DRGの横突起をきれいにします。綿またはゲルフォームを使用して血液を吸収することにより、出血を最小限に抑えるようにしてください。
DRGに触れないように注意しながら、フリードマン-ピアソンロンジャーまたは強力な細かい鉗子を使用して右側のL5横突起を切り開きます。次に、マウスと加熱パッドをカスタムステージに移動します。ステージテープを使用して、動物と加熱パッドを所定の位置に固定します。
動物の鼻をノーズコーンに入れて、イソフルランを継続的に麻酔します。右後足をステージから離れた位置に突き出して固定し、刺激を簡単に適用できるようにします。L5 DRGの吻側と尾側の椎骨または骨盤骨の皮膚にステージクランプで脊椎を所定の位置に固定します。
クランプとステージを調整して、DRGの表面をできるだけ水平にします。次に、ステージを顕微鏡の下に置き、対物レンズが下げたときにDRGの真上8ミリメートルになるようにします。直腸体温計を挿入します。
電力線を加熱パッドと直腸温度計に接続します。ノーズコーンをイソフルランガスラインに接続します。10x 0.4 DIC対物レンズとイメージング用の関連ソフトウェアを備えた正立共焦点顕微鏡を使用します。
495ナノメートルの励起、519ナノメートルの発光、および500〜580ナノメートルの検出波長の緑色のFITCフィルター設定を使用します。顕微鏡下で、DRGの表面を見つけます。ステージのクランプを調整して、DRGサーフェスが可能な限り水平になり、最大表面積が焦点面で視覚化されるようにします。
過剰摂取せずにイソフルラン麻酔を維持するために、手順全体を通して動物を監視します。.顕微鏡高速スキャンプロトコルをロードするには、ボクセルサイズ2.496 x 2.496 x 16ミクロン、512 x 512ピクセル、10光学スライスZスタック、32マイクロメートル用の1つのエアリーユニット、488ナノメートルと5ミリワットの1%レーザー出力、ピクセル時間1.52マイクロ秒、ライン時間0.91ミリ秒、フレーム時間465ミリ秒、LSMスキャン速度8、 双方向スキャン、PMT検出器ゲイン650ボルト、デジタルゲイン1。「取得」タブの「実験の開始」をクリックして、DRGの短い8サイクル・スキャンを実行します。
時間の経過に伴うフレームごとに 1 回のスキャンでスキャンの直交投影を作成して、ムービーを作成します。画像の鮮明さや、DRGを横切る明るさの波などのイメージングアーティファクトを手動で確認します。クランプ位置と光学セクションの厚さを調整し、クリアで高品質のムービーが得られるまでこの手順を繰り返します。
次に、ボクセルサイズ1.248 x 1.248 x 14ミクロン、1024 x 1024ピクセル、6つの光学スライスZスタック、1.2エアリーユニットまたは39マイクロメートル、488ナノメートルおよび25ミリワットの5%レーザー出力、ピクセル時間2.06マイクロ秒、ライン時間4.95ミリ秒、フレーム時間5.06秒、LSMスキャン速度6の典型的な設定を使用して、顕微鏡高解像度スキャンプロトコルをロードします。 双方向スキャン、650ボルトのPMT検出器ゲイン、および1のデジタルゲイン。「取得」タブの下にある「実験の開始」ボタンをクリックして、DRGの高解像度イメージを作成します。顕微鏡ラピッドスキャンプロトコルをロードし、DRGの自発的な活動を80サイクル記録します。
直交投影ムービーを生成し、画像が解析に十分な品質であることを確認します。刺激を加えるには、顕微鏡を15〜20スキャンするように設定します。スキャンが 1 から 5 完了するのを待って、ベースラインを生成します。
スキャン6〜10の間に刺激を適用します。各刺激の後に少なくとも5分間待ってから、次の刺激を適用して脱感作を防ぎます。機械的なプレスの場合は、足に触れずにパドルの間に足を置いてアルゴメーターのピンチャーを持ちます。
スキャン5の終了直後に開始し、スキャン10の直後に停止する足をつまみます。アルゴメーターでプレス力を監視し、希望の力を超えて10gを超えないようにしてください。熱刺激の場合は、ビーカーを希望の温度のすぐ上に加熱します。
水が正しい温度になったら、足を水に浸してスキャン5の直後に刺激を加えます。スキャン10の直後にビーカーを引き離します。外科的L5 DRG曝露とそれに続く共焦点顕微鏡検査により、Pirt-GCaMP3マウスを使用して一度に最大1, 800個のニューロンを画像化することができた。
一次感覚ニューロンは、刺激がない場合、および通常の生理学的状況で刺激に応答して、自発的なカルシウム過渡現象の集団レベルでアンサンブルで観察されました。強い刺激または有害な熱はカルシウム反応を増加させた。100 gで押す場合と比較して、300 gで押すと、カルシウム過渡現象を生成するニューロンの数が増加し、曲線の下のデルタFによってF0の領域が増加しました。
摂氏21度から45度の非有害な温度範囲での温熱は、カルシウム過渡現象を生成するニューロンの数と曲線の下のデルタF×F0領域を増加させました。非有害温度は、摂氏57度の有害な熱刺激と比較して、過渡現象を生成するニューロンの数が少ないことを活性化しました。さらに、小径および中径のニューロンは、すべての刺激下で自発的にカルシウム過渡性を産生したが、大径のニューロンは、300gのプレス刺激に応答してカルシウム過渡性のみを産生した。
DRGは、水平で最適な光学スライス厚さである必要があります。セルの最大数を検出でき、ムービーにうねりがないようにする必要があります。この技術は、体性感覚と味覚の集団レベルで感覚モダリティを分析し、慢性および神経因性疼痛に寄与するペアまたは同期クラスターで活性化する隣接するニューロンを研究するために使用されています。
