当社のFRETプローブとプロトコルは、好中球性気道疾患患者からの痰における自由で表面結合したエラスターゼおよびカテスピンG活性の迅速かつ敏感な定量化を可能にします。これらの方法は、プロテアーゼ病態生理の異なる側面を探索することを可能にする。プレートリーダー測定は、大規模なスクリーニングを可能にします。
共焦点顕微鏡は、細胞内の溶液を用いた酵素活性を可視化します。細胞間測定を流しながら、単一細胞表現型およびプロテアーゼ活性の定量をパーソナライズされた方法で可能にします。この技術は、嚢胞性線維症、気管支拡張症またはCOPDなどの異なる気道疾患に拡大することができる。
血液や気管支アルベオララバスやマウスのサンプルなど、異なるバイオサンプルに適応することができます。痰誘導手順を開始する前に、200マイクログラムのβ2受容体拮抗薬サルブタモールを吸い込む。その後、ネブライザーを用いて15分間、高トニック6%生理液を吸入する。
ペトリ皿に期待された痰を収集します。粘液の塊を唾液からペトリ皿に分け、ピペットチップの助けを借りて。粘液の重量を量り、その後、10%スプトリシンとPBSの重量当たり4つの容積部品を痰に加える。
ロッキングシェーカーの室温で15分間インキュベートし、粘液を溶解します。10%スプートリシンのミリリットルごとに冷たいPBSを1ミリリットル加えて反応を焼き付ける。混合物をピペット化し、均一溶液を得た。
100ミクロンのナイロンセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに混合物をフィルターします。濾過ステップを40ミクロンのストレーナーを通して繰り返し、その後、摂氏4度で300倍Gで10分間遠心分離機を繰り返します。上清を新鮮なチューブに移し、氷の上に保管します。
冷たいPBSの500マイクロリットルで細胞ペレットを静かに再懸濁し、氷の上に置きます。氷上で酵素を解凍し、テキスト原稿に記載されているように酵素標準曲線を設定します。標準的な調製物と並行して、活性化緩衝液中の痰サンプルを希釈する。
プレートリーダーでは、NE FRETプローブNEmo-1の励起波長を354ナノメートル、発光波長をドナー用400ナノメートル、アクセプター用490ナノメートルに設定します。CG FRETプローブsSamの場合、励起波長を405ナノメートル、放出をドナー用485ナノメートル、アクセクサ用580ナノメートルに設定しました。黒96ウェルハーフエリアプレートのウェルにサンプル、標準、またはブランクの40マイクロリットルを追加し、マスターミックスを追加します。
プレートリーダーを起動し、少なくとも20分間、または信号の増加がプラトーに達するまで、60〜90秒ごとに、または受け入れ率の増加をドナーに記録します。データをエクスポートし、各時点およびサンプルのアクソクターRFUでドナーRFUを割ることによってドナーとアクソパチベーター比を計算する。次に、ドナーから受け入れ者の比率平均と標準偏差を計算します。
ドナーの直線的成長の中で、アクテクザクター比の変化に対する傾きを決定する。各測定に対して、1.5ミリリットルチューブ内のPBSの50マイクロリットルの体積に30,000個の痰細胞を再懸濁します。陰性対照として特定の阻害剤を用いて喀痰細胞をインキュベートし、室温で10分間陽性対照として適当な酵素を用いる。
FRETレポーターと核染色を含むPBSを50マイクロリットルずつ各チューブに加え、2マイクロモルの最終濃度を得ます。混合物を室温で10〜20分間インキュベートする。100マイクロリットルの氷冷PBSを加えて反応を焼き付け、サンプルを氷の上に置きます。
顕微鏡スライド上の混合物を細胞回転させる。その後、空気乾燥し、10分間冷たい10%メタノールで細胞を固定します。固定後、空気乾燥し、適切な取り付け媒体でサンプルを取り付けます。
共焦点顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。決定的な統計を得るための、1 つの条件につき少なくとも 100 個のセルを画像化します。5ミリリットルのFACSポリスチレン丸底管にPBSの100マイクロリットルで100万個の細胞を再懸濁し、氷の上にチューブを置きます。
各サンプルに2マイクロリットルのFCブロックを加えます。その後、室温で5分間サンプルをインキュベートします。各チューブに抗体を加え、暗闇の中で氷の上で30分間インキュベートします。
冷たいPBSと遠心分離機の2ミリリットルで細胞を300倍Gと摂氏4度で洗います。最後に、PBSの200マイクロリットルで再中断します。懸濁液を2つのチューブ、それぞれ100マイクロリットルに分割し、5マイクロリットルの細胞生存性染色を加えます。
陰性対照管に適切な特定のNSP阻害剤を加え、暗い温度で10分間サンプルをインキュベートする。PBSをサンプルに加え、40ミクロンのフィルターを通してきれいなFACSチューブにフィルターします。ネガティブコントロールサンプルにレポーターを加え、穏やかに渦を出します。
この特定の阻害剤とインキュベート細胞を取得し、必要に応じて、わずかにゲートだけでなく、レポーターのPMTs電圧を調整します。ドナーの変化を記録して膜結合プロテアーゼ活性による比率を受け入れ、各チューブから5~10分ごとに1000個の好中球を記録する。ゲートされた生存性単一好中球で測定されたサンプルのアクセプタチャネル値でドナーを割ってFRET比を計算します。
100ミクロモルシビレスタットで事前にインキュベートされた好中球の画像、またはレポーターNEmo-2の追加前に未処理のままにした画像がここに示されています。核信号は、その特性セグメント化された核によって好中球を同定するために使用され、ROIを手動で選択した。痰好中球の比率を受け入れるドナーをプロットした。
各ドットは、1 つの ROI の平均を表します。フローサイトメトリーの測定は、痰好中球を判別し、研究することを可能にする。レポーター添加後、0分および10分でMFI分布が観察された。
1000個の痰好中球に対する平均ドナーおよびアクセプターMFI値を計算した。D/A比は、最初の増加後に高原に達した。健康なドナー痰誘導は完璧の前にいくつかの練習を取る。
リラックスして、エゾルゾルを10〜15分間呼吸することを忘れないでください。また、常に喀痰細胞を氷の上に置いて、出物の後、できるだけ早く処理します。表面結合プロテアーゼ活性は、小児の早期肺損傷および成人CF患者における肺疾患の重症度と相関することを発見した。
したがって、これらの方法は、好中球性気道疾患における初期炎症バイオマーカーとしてのプロテアーゼの探索を可能にする。
