この方法は、生物学的サンプルにおけるキチナーゼ活性を定量化するより効果的な方法を可能にする。チチナーゼ活性は、多くの状態および疾患における診断および治療効果のための良好なマーカーとして役立つことを示している。チチナーゼ活性の測定のための以前の方法は、多くの場合、時間がかかり、実行することが困難であった、ここで示すアッセイによって解決された両方の問題。
この技術は、チチナーゼ活性を測定しやすくすることで、診断および治療マーカーとしての潜在的なチチナーゼを満たすのに役立ちます;例えば、チチナス活性が効果的な治療中に減少することが示されているので、ゴーシェ病の治療を監視するために使用することができます。まず、アッセイ用の基板、規格、およびソリューションを準備します。原稿の指示に従って1x McIlvainバッファーを調製し、キチン基板をそれぞれ500マイクロモルに希釈するために使用します。
4-メチルウンベリフェロン、標準、停止バッファー内の0.1ミリモルの濃度に溶解し、標準的な曲線ストック溶液を作成します。10サンプルごとに、1x McIlvainバッファーの2.17ミリリットルをキチン基板の100マイクロリットルと混合して、作業溶液を作り、96ウェルプレートの各ウェルに95マイクロリットルの作業溶液を作ります。テストサンプルを5マイクロリットルずつ各ウェルに加え、作業溶液に混ぜます。
プレートを覆い、5秒間振り、37°Cで15分間インキュベートして酵素反応を起こす。一方、4-メチルウンベリフェロンのストック溶液を希釈して5マイクロモル作動標準溶液を作り、原稿に従って一連の希釈を調製して標準曲線を作成する。5マイクロモル濃度から始め、各希釈をよく混ぜます。
インキュベーション後、各ウェルに200マイクロリットルのストップバッファーを加えて反応を停止します。各規格の300マイクロリットルの複製を同じプレートに加え、360ナノメートルの励起と455ナノメートルの放出でプレートを読み取ります。このプロトコルは、野生型の気管支肺胞洗浄および血清液中のキチナーゼ活性と、トランスジェニックマウスを過剰発現するキトトリシダーゼの測定に成功した。
このアッセイは、マウスにおけるCHIT-1遺伝子の過剰発現が、チチナーゼ活性の増加をもたらすことを確認する。サンプルの蛍光に基づいてキチナーゼを決定するために標準曲線を使用した。最初にプロトコルを試みる際に覚えておくべきことは、完全に混合しながら、できるだけ迅速かつ効率的にサンプルを追加することです。
最初に開始する場合、インキュベーション期間が短いため、測定の精度を確保するために、1回の実行あたりのサンプル数を減らすことが有益な場合があります。
