形質細胞は、特にヒトにおいて完全な生物学的特性評価を損なう解剖学的位置で行われている30の分化段階を有する稀な細胞である。インビトロB2の血漿細胞分化モデルは、生体内の異なる器官で起こる逐次細胞の分化と成熟を再現しています。このin vitroモデルは、協調転写変化と、生体内で検出できる異なるB2形質細胞段階の表現型を再現する。
また、プラズマ細胞の分化に関連する探査データから最も顕著な情報を分析するためのオープンアクセスバイオインフォマティクスツールを構築しました。手順を実証することは、私の研究室のポスドクであるユーグ・ド・ブサックです。まず、健常なボランティアから末梢血細胞を得て、メモリB細胞を精製する。
7.5ミリリットルの血液をRPMI 1640培地24.5ミリリットルで希釈する。次に、無菌の50ミリリットルの円錐管に12.5ミリリットルの室温密度勾配を加えます。濃度勾配を32ミリリットルの希釈血液で優しく重ね、2つの相の混合を最小限に抑えます。
ブレーキをオフにして500倍の重力で20分間遠心分離機。希釈された血漿および密度勾配界面から末梢血単核細胞を収集する。細胞を無菌50ミリリットルチューブに移し、ハンクのバランス塩溶液で最大45ミリリットルのチューブを充填します。
5分間の500倍の重力で遠心分離機。上清を慎重に取り除き、ペレットを保管します。その後、RPMI 1640培地の45ミリリットルを加え、10%FCSを添加する。
5分間の500倍の重力で遠心分離機。上清を慎重に取り除き、ペレットを保管します。PBSの30ミリリットルを追加, で補います 2%FCS.
1つのターゲットセルに4つのビーズを加えることでCD陽性細胞を除去するために、抗CD磁気ビーズを使用してください。摂氏4度で30分間インキュベートします。細胞分離アプリケーションに磁石を使用して、ビーズ結合細胞を非結合セルから分離します。
非結合細胞を収集し、抗CD19 APCおよび抗CD27 PE抗体を摂氏4度で15分間インキュベートします。10%ヤギの血清を含むPBSで細胞を2回洗浄します。次いで、細胞選別機を用いて、メモリB細胞を純度95%まで精製する。
この後、可溶性CD40リガンドと抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体を追加して、メモリーB細胞活性化を行います。精製したメモリB細胞をインターロイキン-2、インターロイキン-10、インターロイキン-15で4日間、6ウェル培養プレートにプレートします。遺伝子発現プロファイリングの場合、細胞選別機を使用して、4日目にCD38陰性CD20陰性プレプラズマ芽細胞を精製します。
4日目に、細胞を数え、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えることによって、1ミリリットル当たり250,000個の細胞密度で12ウェル培養プレートにプレートします。分化を誘導するには、CPGオリゴヌクレオチドおよび可溶性CD40リガンドを除去し、インターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン-10およびインターロイキン-15を含む新しいサイトカインカクテルを含む新しい培養培地を添加する。37°Cで3日間細胞を培養します。
遺伝子発現プロファイリングの場合、細胞ソーターを使用して、7日目にCD38陽性、CD20陰性プラズマ芽細胞を精製します。7日目に、セルを数えます。12ウェル培養プレートに細胞を12ウェル培養プレートに500,000個の細胞密度でプレートし、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。
インターロイキン-6、インターロイキン-15、インターフェロンアルファを含む新鮮な培地を摂氏37度で3日間使用して、プラズマ芽細胞を初期の形質細胞に分化する。遺伝子発現プロファイリングの場合、細胞ソーターを使用して、CD20陰性、CD38陽性、CD138陽性初期の形質細胞を10日目に精製します。まず、培養液で5日間の間質細胞を培養する。
0.2マイクロリットルフィルターを使用して、間質細胞培養上清を濾過し、間質細胞コンディショナー培地を得て、使用できる状態になるまで凍結します。次に、初期の形質細胞を12ウェル培養プレートで培養し、前に得られた間質細胞培地をインターロイキン-6およびAPRILで、ウェル当たり500,000個の細胞密度で使用し、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えた。摂氏37度でインキュベートし、毎週間質細胞調節培地を更新する。
次に、フローサイトメトリーソート血漿細胞からの免疫グロブリン分泌を測定する。1ミリリットル当たり100万個の密度で24時間、形質細胞を培養し、培養上清を収穫する。ELISAキットを用いて、免疫グロブリンG、および免疫グロブリンA.Firstを測定し、GenomicScapeオープンアクセスバイオインフォマティクスウェブツールを起動します。
データの参照メニューで、ヒト B 細胞という名前のデータセットを、形質細胞に選択します。分析ツールの発現/共発現レポートツールを使用して、ユニークな遺伝子の遺伝子発現プロファイルまたは遺伝子リストの可視化が可能です。次に、分析ツール webSAM を選択して SAM ツールをロードします。
ヒトB細胞から形質細胞へのデータセットを選択し、比較するサンプルのグループを選択します。使用できるさまざまなフィルターを使用して、対象のフィルター・オプションを適用します。SAM ツールで遺伝子発現プロファイルを比較するには、フォールド変更、順列数、偽発見率、比較の種類などのフィルタリングオプションを変更します。
ソフトウェアは分析を計算し、選択したグループ間で遺伝子を差し出して提供します。本研究では、正常な形質細胞分化におけるエピジェネティック因子の発現変化を調べる。多クラスSAM分析を用いて、71個の遺伝子が、5%以下の偽発見率を有するメモリB細胞、プレプラズマ芽細胞、プラズマ芽細胞および骨髄形質細胞の間で有意に差が発現することが分かる。、ヒストンデメチル酵素の21.74%、メチル結合タンパク質の4.35%、ヒストンデアセチラーゼの4.35%。
14エピジェネティックプレーヤー遺伝子は、ヒストンメチルトランスレシエーアーゼの50%、DNAメチルトランスレシエーアーゼの14.28%、ヒストンデアセチラーゼの21.43%、ヒストンデメチル酵素の7.14%、ヒストンアセチルトランス酵素の17.14%を含むプレプラズマ芽細胞段階で有意に過剰発現している。この手順に従って、これらのB2血漿細胞分化中にクロマチン構造およびアーキテクチャにおける修飾を同定し、理解するためのいくつかの分析が行われる。このin vitro分化モデルは、この分子解析を完了するのに十分な細胞を生成し、この全体のモデリングに関与する経路とB2血漿細胞分化中の下流転写影響の両方を明らかにすることを可能にする。
この研究から得られたこの知識は、より良い予後と改善された治療戦略が非常に必要とされる決定的な治療法のない癌である多発性骨髄腫の場合のような形質細胞疾患の診断および治療戦略を知らせ、指導することができる。B2血漿細胞分化中にクロマチンに影響を与えるエピジェネティックリモデリング構造および建築変化を特徴付け、理解することは特に興味深いものです。これは、遺伝子シーケンシング、ERRBS、ATACシーケンシング、IC、およびRNAシーケンシングを使用して行われます。
中程度の異質性は、健常ドナーの血液に応じて、活性化されたB細胞、プレプラズマ芽細胞、プラズマ芽細胞および形質細胞の割合で観察され、記憶B細胞の精製に使用される。
