NETは最近注目を集めていますが、生体内でNETを定量することは困難であることが証明されています。このプロトコルは、臨床現場でNETの特性を調査するための、望ましく、高感度で、価値のある方法を提供します。この技術は、敗血症または敗血症性ARDS、急性呼吸窮迫症候群の重症度を評価するために拡張する必要があります。
ダンプまたは損傷に関連する分子パターンを調節することが敗血症の臨床状態を改善するための鍵であることは広く受け入れられています。この方法の最大の利点は、ミエロペルオキシダーゼ-DNAや好中球エラスターゼ-DNAなどの循環NET残骸を短時間で正確に定量できることです。アッセイの前にサンプルを回転させ、繰り返しの解凍を避けることをお勧めします。
プロトコルに記載されているインキュベーション時間に従うことが重要です。新たに単離した多形核好中球をフェノールレッドフリーRPMI 1640で1ミリリットルあたり10, 000細胞に希釈することから始めます。35ミリメートルの培養皿でそれらをふるいにかけます。
好中球細胞外トラップまたはNETを誘導するには、まず25ナノモルのPMAで多形核好中球を刺激します。次に、DNase Iのミリリットルあたり0.6マイクログラムを添加して細胞外トラップを部分的に消化し、混合物を室温で50分間インキュベートします。次に、5ミリモルのEDTAを加えてDNase活性を停止させ、合成されたNETを含む培地を収集します。
遠心分離機で細胞残渣を除去する。4つの健康な対照から上清を収集します。さらに使用するために、摂氏マイナス80度で混合して保管します。
0.05マイクログラムの抗体を含む100マイクロリットルの希釈抗ミエロペルオキシダーゼをELISAプレートにピペットで入れます。次に、サンプルの蒸発を防ぐためにプレートを粘着性のプラスチックカバーで覆い、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートして、捕捉抗体の結合を可能にします。翌日、希釈した抗体溶液をウェルから捨て、300マイクロリットルの洗浄溶液を各ウェルにピペットで入れた。
ペーパータオルでプレートを軽くたたいて乾かし、余分なPBSを取り除きます。プレートの各ウェルを200マイクロリットルのブロッキングバッファーでブロッキングします。それを粘着性のプラスチックカバーで覆い、それをインキュベートすることによってウェルを塞ぐ。
ブロッキング溶液をウェルから廃棄し、プレートを3〜4回洗浄した後、ペーパータオルで軽くたたいて乾かします。次に、ブランクを除くすべてのウェルに25マイクロリットルの血漿をピペットで入れます。そしてそれを75マイクロリットルのPBSで希釈し、最終的なウェル容量を100マイクロリットルにします。
次に、100マイクロリットルのPBSをブランクウェルに追加します。プレートをシェーカーに置き、室温で250 rpmで10秒間、サンプルを混合します。2マイクロリットルの100完全希釈DNase Iをすべてのウェルに加え、密封プレートをシェーカーに10秒間置き、サンプルを完全に混合します。
室温で15分間インキュベートします。各ウェルに1マイクロリットルの0.5モルEDTAを加えて、DNase反応を停止させます。次に、密封されたプレートをシェーカーに15秒間置き、サンプルを完全に混合します。
最後に、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートして、NETのタンパク質成分が捕捉抗体に付着できるようにします。翌日、ウェルから溶液を捨てます。複数回ウェル洗浄した後、希釈したペルオキシダーゼ結合抗DNA検出抗体100マイクロリットルを各ウェルにピペットで入れる。
プレートを1時間半インキュベートしてから、ウェル内の溶液を廃棄します。ウェルを3回洗浄した後、100マイクロリットルのABTS基質溶液を各ウェルにピペットで入れ、密閉プレートを暗所の振とう機上でインキュベートした。50マイクロリットルの2モル硫酸を加えて反応を停止します。
プレートの側面を慎重に叩いてウェルの内容物を混ぜます。次に、マイクロプレートリーダーをコンピューターに接続し、ソフトウェアアプリケーションを起動します。ステータス バーから、新しい実験を作成し、名前を付けます。
次に、読み取りタイプとして吸光度、読み取りモードとしてエンドポイント、波長として2を選択して、プレート読み取りパラメーターを設定します。次に、ラムダ1を405ナノメートル、ラムダ2を490ナノメートルに設定します。次に、オートキャリブレーションをオンのままにして、オートミックスとブランキングの両方のオフステータスを選択します。次に、ストリップの下のプレート全体を読み取るを選択します。
最後に、キャリッジ速度として [標準] で [列の波長の優先順位] を設定し、[自動読み取り] で [オフ] を選択します。プレートを計器の引き出しにしっかりと置き、閉じます。[読み取り]をクリックして、プレートがすぐに読み取られるようにします。
405ナノメートルで各ウェルの吸光度を読み取り、すべての未知のサンプルからアッセイ媒体の吸光度を自動的に減算します。MPO-DNAとNE-DNAの両方で、吸光度値がそれぞれ0.93と0.9を超えない場合、信頼できる標準検量線が得られました。最も高いODは、DNaseIのミリリットルあたり0.6マイクログラムを適用したときに得られた。
健常対照群の複合体のアッセイ間変動係数はそれぞれ1.871と0.987でしたが、COVID-19患者はそれぞれ2.532と2.010の変動係数を示しました。MPO-DNAおよびNE-DNAの平均アッセイ間変動係数はそれぞれ6.524および4.389であった。捕捉抗体のMPO-DNAおよびNE-DNA複合体に対する特異性は、アイソ型コントロール抗体が複合体にほとんど反応しないことを示した。
両方の複合体の割合は、健康な対照と比較して、COVID-19患者の血漿中で高かった。DNase消化時間を最適化する必要があります, そうでなければ、過度の消化は吸光度を低下させます.
