このインビトロイメージングアッセイは、異なる細胞処理または異なる遺伝子型が微小グリア貪食症に及ぼす影響を定量化することを可能にする。神経変性疾患に関連する2つの細胞タイプを使用して、我々は大きな高含有画像画面によって容易かつ安価にスケールアップすることができる方法で調製される貪食性貨物に死んだ神経芽細胞細胞を使用する。クラス2の生物学的安全キャビネットにおいて、培地を吸引することによってSH-SY5Ysを解負する。
4mlの細胞解離バッファーを加え、細胞をコーティングする薄膜として1ml未満となるように直ちにバッファーを取り出します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜3分間インキュベートします。その後、10mlのHBSSでT-75フラスコに。
そして、SH-SY5Ysを15ml円錐形遠心分離管にピペットします。400xGで5分間遠心分離機。上清を吸引し、2mlのフェノールを赤く含まないHEPES緩衝培地で細胞を再懸濁し、固定前に塊を分解することを確認する。
2mlの4%パワーホルムアルデヒドをチューブに加え、時折穏やかな攪拌で室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。チューブに10mlのHBSSを加えます。その後、1200xGで遠心分離機を7分間行う。
上清を吸引し、2mlのフェノールを赤含まないHEPES緩衝培地中で細胞ペレットを再懸濁させた。2 ml の低タンパク質結合チューブに 100 万の HS-SY5Y 細胞を数え、除去します。総容量をフェノールを赤く含まないHEPES緩衝媒体で300~500マイクロリットルにします。
その後、37°Cの水浴でチューブを簡単に温めます。メーカーの指示に従って、pHに敏感な赤色蛍光色素STPエステルを再構成します。その後、100万個のSH-SY5Y細胞あたり12.5マイクログラムの染料を添加します。
チューブをフリックしてやさしく混ぜます。そして、光から保護された30分間室温でチューブをインキュベートします。1200xGでHBSSと遠心分離機を1ml加え、7分4度で摂氏4度。
上清を捨てます。そして、HBSSの2 mlで洗浄します。フェノール赤自由マクロファージ培地中の細胞ペレットを1ml当たり0.2〜120万細胞の濃度に再懸濁し、50マイクロリットルが10,000〜60,000細胞を含むことになります。
生物学的安全キャビネットにおいて、マクロファージ培地中のコシニミジルエステル反応性色素を意味する深赤色蛍光細胞の溶液を調製する。Hoechst 33342を追加し、水浴で37°Cに作業溶液を温めます。iPSCマクロファージ培地を優しく吸引し、マルチチャネルピペットを用いて細胞上清を無菌貯留槽にピペット化する。
マルチチャンネルピペットを使用して、色素溶液のウェルあたり70マイクロリットルをiPSCマクロファージに加えます。摂氏37度と5%の二酸化炭素で1時間インキュベートします。フェノール赤自由マクロファージ培地での実験的治療を修復する。
インキュベーション後、iPSCマクロファージ培地をマルチチャンネルピペットで非常に穏やかに吸引し、ウェルあたり100マイクロリットルのHBSSを加える。穏やかなピペットによってすぐにHBSSを取除く。次に、100マイクロリットルのフェノールを赤自由マクロファージ培地に加え、別々のウェルで実験的な処理を加えます。
摂氏37度と5%の二酸化炭素で10分から1時間インキュベートします。マルチチャンネルピペットを使用して、液体の端にある各ウェルの側面からウェルあたり50マイクロリットルのSH-SY5Ysを追加します。その後、摂氏37度、炭酸ガス5%で3~5時間インキュベートします。
食細胞化後、マルチチャネルピペットでピペット処理して細胞上清を軽く吸引し廃棄する。PBS 100マイクロリットルで1回洗浄します。その後、2%のパワーホルムアルデヒドの100マイクロリットルを加え、室温で15分間インキュベートして細胞を固定します。
井戸を吸引し、PBSの100マイクロリットルを追加します。高含有顕微鏡で直接撮像を進めるか、またはプレートシーラーとホイルで覆い、必要になるまでプレートを摂氏4度で保存します。高コンテンツイメージング顕微鏡をオンにし、画像キャプチャソフトウェアを開きます。
画面の上部にある「LOAD」アイコンをクリックして、アッセイプレートを顕微鏡にセットします。[セットアップ]タブを選択します。左上のボックスのドロップダウンメニューで、適切なプレートタイプを選択します。
オートフォーカスオプション:2つのピーク「目的:40x水、NA 1.1"共焦点"モード、およびビニング1。設定メニューから使用する前に、40x Waterの目的をフラッシュします。チャンネル選択ボックスで、プラスアイコンを使用してチャンネルDAPI、Alexa 647、Alexa 568を追加します。
1マイクロメートルの単一平面で測定するためにこれらを設定します。アッセイプレートの染色効率に関する時間と電力設定を最適化します。チャンネルシーケンスをクリックしてチャンネルを分離し、チャンネルを同時に測定しないようにします。
ナビゲーションとレイアウトを定義する下で、測定のウェルを選択し、ウェルごとに 9 ~ 12 のフィールドを選択します。セットアップ中に、プレート マップの代表フィールドをクリックします。また、各測定チャンネルを順番に確認して、染色が存在し、チャンネルオフセットを調整して画像が焦点を合わせられるようにします。
リモート分析のためにデータをサーバーにアップロードするには、オンラインジョブのボックスと関連する画面名をクリックします。「保存」ボタンをクリックしてアッセイプロトコルを保存し、上部にある実行実験」タブをクリックします。実験プレートに名前を付け、開始をクリックしてください"生細胞の時間が貪食アッセイは、10で、 1ウェル当たり000 SH-SY5Ysは、細胞当たりの食細胞粒子の数は時間とともに直線的に増加し、サイトカラシンD.1井戸当たりのSH-SY5Ysの量が多いほど、iPSCのセグメント化不良のために、食作用が悪い直線性を示し、 マクロファージ、およびSH-SY5Ysは、より混雑した視野で。
以下の結果は、この代表的な食細胞細胞化の画像を含む、固定細胞高含有物イメージングを行った。SH-SY5Ysの量を増加させると、細胞当たりの貪食細胞粒子の数が増加した。貪食アッセイは、いくつかの貪食抑制剤を用いて検証した。
サイトカラシンDおよびジャスプラキノリドは、それぞれ91%および90%の顕著な食前細胞化を阻害した。バフィロマイシンA1は、食細胞化前に1時間前培養した場合に食細胞化を31%有意に減少させた。組換えアネキシン5の添加はSH-SY5Y添加の直前にウェルに添加すると食細胞性を30%有意に減少させた。
固定SH-SY5Ys蛍光アネキシン5プローブを使用してホスファチジルセリンを暴露することが確認されています。一方、生きたSH-SY5Ysはアネキシン5染色に対して陰性であった。幾つかの長さの貪食持続時間は、1〜5時間、貪食性貨物の驚異的な添加を用いて試験した。
このプロトコールの全長は、貪食性貨物を調製し、iPSCマクロファージを並行して染色することによって短縮することができる。これを行う場合は、事前にタイミングを考え出し、インキュベーションを使用して今後のステップに向けたソリューションを準備してください。
