CNS転移に対する新しい治療法の開発は、優れた前臨床モデルの欠如によって妨げられてきました。私たちの患者由来の異種移植片モデルは、歴史的に使用されていた細胞株モデルよりもCNS転移をよりよく再現します。腫瘍接種のさまざまな経路を利用することにより、転移カスケードのさまざまな側面を研究することができます。
各ルートには、研究に活用できる利点があります。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクであるBen Yi Tewです。凍結保存されたPDX腫瘍の皮下側面移植の場合、凍結保存された腫瘍組織を摂氏37度の水浴中で迅速に解凍します。
次に、組織培養皿で5ミリリットルのDPBSですすいでください。次に、3〜8週齢の雌NOGマウスで麻酔を確認した後、左右の脇腹を0.5〜1センチメートル切開し、2×2×2ミリの腫瘍組織片をポケットの奥深くに挿入します。切開部を閉じた後、マウスが外来になるまでモニタリングしながら麻酔から回復させます。
腫瘍が成長し始めたら、キャリパーで週に3回腫瘍を測定します。適切な実験エンドポイントで、剖検によって転移を特定し、組織学的分析を通じて標的臓器内の腫瘍の存在を確認します。切除したPDX腫瘍を氷上のDMEMに入れます。
組織培養皿で5ミリリットルのDPBSで腫瘍を洗浄し、壊死領域がある場合は除去します。腫瘍を2〜4ミリメートルの長さの小さな小片に切断し、解離溶液を含むチューブに移します。Dissociatorで適切なプログラムを使用して、組織を機械的に解離し、得られた細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーに通します。
20ミリリットルのDMEMを使用して、ストレーナーから残りの細胞を洗浄し、解離した細胞懸濁液を遠心分離します。次いで、細胞およびDPBSを再懸濁し、DPBSを計数するために、DPBS1〜2マイクロリットルの細胞あたり10〜4番目の細胞を5〜10倍の濃度に調整する。手術領域を準備するには、マウスの頭の毛皮を剃って頭皮を露出させます。
次に、マウスを定位固定装置フレームに入れ、イヤーバーを使用してマウスの頭をしっかりと固定します。適切な鎮痛剤も投与してください。ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで頭皮を消毒します。
頭蓋骨を露出させ、頭皮を引っ込めるために5〜7ミリメートルの縦切開を行います。鉗子で骨膜をこすり落とし、ブレグマを見つけます。定位フレームの針をブレグマの上に置き、座標をゼロにリセットします。
腕を正中線の右に1ミリメートル後方、横1ミリメートル動かし、この位置に永久マーカーで印を付けます。次に、脳に穴を開けないように注意しながら、マークされた場所の頭蓋骨に小さなバリ穴を開けます。1〜2マイクロリットルのセルを備えた5マイクロリットルの26ゲージハミルトンシリンジにロードし、シリンジを定位固定装置アームに取り付けます。
針をゆっくりと2ミリメートル脳に挿入し、希望の速度で細胞を注入し始めます。すべての細胞が送達されたら、針をゆっくりと引っ込め、バリの穴を骨ワックスで埋め、切開部を閉じます。麻酔から回復するまで監視しながらマウスをケージに戻します。
適切な実験エンドポイントで動物を安楽死させた後、組織学的分析を通じて脳内の腫瘍の存在を確認します。心臓内注射によってPDX腫瘍を移植するには、実証されたように腫瘍細胞を準備し、麻酔をかけたレシピエントマウスを仰臥位に置きます。動物の胸の毛皮を剃り、露出した皮膚をポビドンヨードと70%エタノールで消毒します。
28ゲージの針を備えた注射器に、10〜5番目の腫瘍細胞の0.5〜10倍と最大100マイクロリットルのDPBSを引き込みます。胸骨ノッチと剣状突起の中間の胸骨のわずかに左に注射部位を配置します。次に、注射部位のマウスに針を垂直に挿入します。
逆流が観察され、針が左心室にうまく進入したことを示すようになったら、針を動かさずに腫瘍懸濁液をゆっくりと左心室に分注します。すべての細胞が送達されたら、針をゆっくりと垂直に引っ込め、出血が止まるまで約1分間、滅菌ガーゼを注射部位に塗布します。マウスが歩行可能になるまで監視しながら、加熱パッド上でマウスを回復させます。
適切な実験エンドポイントで、剖検によって転移を特定し、組織学的分析を通じて標的臓器内の腫瘍の存在を確認します。腫瘍の微小環境の違いにもかかわらず、PDX腫瘍は、移植部位に関係なく、小さな核と乏しい細胞質を持つ細胞を含む同様の形態を示します。この解析では、ヒトメラノーマ細胞の心臓内注射はマウス脳への腫瘍細胞の転移をもたらし、脳転移ヒト小細胞肺癌腫瘍細胞の心臓内注射はマウス腹腔および肝臓への転移をもたらした。
これらのプロトコルは、新しい治療法と治療の組み合わせをテストするための前臨床試験の設定を可能にし、生物学的プロセスと腫瘍転移の研究に役立ちます。
