Le développement de nouvelles thérapies pour les métastases du SNC a été entravé par le manque de bons modèles précliniques. Nos modèles de xénogreffe dérivés de patients récapitulent mieux les métastases du SNC que les modèles de lignées cellulaires utilisés historiquement. En utilisant différentes voies d’inoculation tumorale, vous pouvez étudier différents aspects de la cascade métastatique.
Chaque itinéraire présente des avantages qui peuvent être exploités pour votre étude. La démonstration de la procédure sera assurée par Ben Yi Tew, un boursier postdoctoral de mon laboratoire. Pour l’implantation sous-cutanée de flanc de tumeurs PDX cryoconservées, décongelez rapidement le tissu tumoral cryoconservé dans un bain-marie de 37 degrés Celsius.
Ensuite, rincez-le dans cinq millilitres de DPBS dans un plat de culture tissulaire. Ensuite, après avoir confirmé l’anesthésie chez une souris NOG femelle âgée de trois à huit semaines, faites une incision de 0,5 à un centimètre sur le flanc gauche ou droit et insérez un morceau de tissu tumoral de 2x2x2 millimètres profondément dans la poche. Après avoir fermé l’incision, laissez la souris récupérer de l’anesthésie avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire.
Une fois que la tumeur commence à se développer, mesurez la tumeur trois fois par semaine avec un pied à coulisse. Au critère d’évaluation expérimental approprié, identifier les métastases par nécropsie et confirmer la présence de tumeurs dans l’organe cible par une analyse histologique. Placez la tumeur PDX réséquée dans DMEM sur de la glace.
Lavez la tumeur dans cinq millilitres de DPBS dans une boîte de culture tissulaire et retirez les régions nécrotiques s’il y en a. Coupez la tumeur en petits morceaux de deux à quatre millimètres de longueur et transférez les morceaux dans un tube contenant une solution de dissociation. À l’aide du programme approprié sur un dissociateur, dissociez mécaniquement le tissu et filtrez la suspension cellulaire résultante à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres.
Utilisez 20 millilitres de DMEM pour laver les cellules restantes de la crépine et centrifuger la suspension cellulaire dissociée. Ensuite, remettez en suspension les cellules et le DPBS pour le comptage et ajustez les cellules à une concentration de cinq à 10 fois 10 à la quatrième cellule par un à deux microlitres de DPBS. Pour préparer la zone chirurgicale, rasez la fourrure sur la tête de la souris pour exposer le cuir chevelu.
Ensuite, placez la souris dans un cadre stéréotaxique, en fixant fermement la tête de la souris à l’aide de barres d’oreille. Assurez-vous également d’administrer un analgésique approprié. Désinfectez le cuir chevelu avec trois gommages alternés de povidone-iode et d’éthanol à 70%.
Faites une incision longitudinale de cinq à sept millimètres pour exposer le crâne et rétracter le cuir chevelu. Grattez le périoste avec une pince pour localiser le bregma. Placez l’aiguille du cadre stéréotaxique sur le dessus du bregma et réinitialisez les coordonnées à zéro.
Déplacez le bras d’un millimètre en arrière et d’un millimètre latéral à droite de la ligne médiane, et marquez cet emplacement avec un marqueur permanent. Ensuite, percez un petit trou de bavure dans le crâne à l’endroit marqué, en prenant soin de ne pas percer dans le cerveau. Charger sur cinq microlitres seringue Hamilton de calibre 26 avec un à deux microlitres de cellules et fixer la seringue au bras stéréotaxique.
Insérez lentement l’aiguille de deux millimètres dans le cerveau et commencez à injecter des cellules à la vitesse souhaitée. Lorsque toutes les cellules ont été livrées, rétractez lentement l’aiguille, remplissez le trou de la bavure avec de la cire osseuse et fermez l’incision. Replacez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à la récupération de l’anesthésie.
Après avoir euthanasié l’animal au point d’évaluation expérimental approprié, confirmer la présence de tumeurs dans le cerveau par une analyse histologique. Pour implanter des tumeurs PDX par injection intracardiaque, préparez les cellules tumorales comme démontré et placez la souris receveuse anesthésiée en décubitus dorsal. Rasez la fourrure sur la poitrine de l’animal et désinfectez la peau exposée avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70%.
Aspirez 0,5 à 10 fois 10 aux cellules tumorales cinquièmes et jusqu’à 100 microlitres de DPBS dans une seringue équipée d’une aiguille de calibre 28. Situez le site d’injection légèrement à gauche du sternum à mi-chemin entre l’encoche sternale et le processus xiphoïde. Ensuite, insérez l’aiguille verticalement dans la souris au site d’injection.
Une fois que le reflux est observé, indiquant une entrée réussie de l’aiguille dans le ventricule gauche, distribuez lentement la suspension tumorale dans le ventricule gauche sans déplacer l’aiguille. Lorsque toutes les cellules ont été livrées, rétractez lentement et verticalement l’aiguille et appliquez un morceau de gaze stérile sur le site d’injection pendant environ une minute jusqu’à ce que le saignement cesse. Laissez la souris récupérer sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire.
Au critère d’évaluation expérimental approprié, identifier les métastases par nécropsie et confirmer la présence de tumeurs dans l’organe cible par une analyse histologique. Malgré les différences dans le microenvironnement tumoral, les tumeurs PDX présentent des morphologies similaires contenant des cellules avec de petits noyaux et peu de cytoplasme, quel que soit le site d’implantation. Dans cette analyse, l’injection intracardiaque de cellules de mélanome humain a entraîné des métastases des cellules tumorales dans le cerveau de la souris, tandis que l’injection intracardiaque de cellules tumorales de cancer du poumon humain à petites cellules métastasant le cerveau a entraîné des métastases à la cavité abdominale et au foie de la souris.
Ces protocoles permettent la mise en place d’études précliniques pour tester de nouveaux traitements et combinaisons de traitements, et peuvent aider à étudier les processus biologiques et les métastases tumorales.
