モデルは、リンパ節との相互作用を通じて癌転移を模倣するために一貫して必要とされる。膀胱の大腸癌および尿路上皮細胞癌の両方を有する患者において。本論文に記載されている直交異様な異種モデルは、これらの重要な生物学的問題に答え、新しい治療法を効率的かつ臨床的に関連する方法でテストするのに役立ちます。
マウスで産生される私たちの異交性異種移植片腫瘍は、患者の腫瘍に似ています。リンパ節間質細胞の存在下では、両方のモデルは、より高い腫瘍移植および遠くの臓器転移率およびヒト転移パターンを模倣する場所を有する。また、どちらの動物モデルも手続き関連の死亡率がゼロです。
安楽死させたマウスから患者由来の腫瘍を除去した後、滅菌手術用はさみを使用して、ラミナーフローフードの下のシャーレでルシファーゼ陽性腫瘍片をできるだけ小さくミンチする。腫瘍片を無菌50 mL円錐管に移す。消化液を調製するには、コラゲターゼ4型10mL、ヒアルロニダーゼ80マイクロリットル、160マイクロリットルのデオキシリボヌクレアーゼタイプ1~40mLのHBSSを加え、反転して混ぜます。
35~40 mLの消化液を細かくした腫瘍に加え、周期的な激しい揺れで2時間連続回転して摂氏37度でインキュベートします。消化後の破片を除去するには、滅菌100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して消化された腫瘍を濾過し、その後40マイクロメートルの細胞ストレーナーを濾過し、毎回50mLチューブ内の流れを節約し、破片を廃棄します。自由な細胞を洗浄するには、20 mLのHBSSを流れに加え、遠心分離機を329倍の重力で5分間加えます。
上清を吸引し、HBSSの30mLでペレットを再懸濁します。100,000個の腫瘍細胞を無菌15 mL円錐管に移し、300,000個の先に調製した新鮮なHK細胞を加える。5分間重力329倍の細胞を遠心分離し、吸引によって上清を捨てる。
完全なRPMI培地で細胞を再懸濁し、使用できるまで氷の上に保管してください。UCC細胞注射のために動物を準備するには、6-8週齢の雌のNOD-SCIDマウスの腰を剃るために脱毛クリームを使用してください。膀胱にUCC細胞を投与するには、まず4ワットの電力に単極電気コーテリー機械を設置する。
マウスを麻酔した後、鼻コーンをイオブルランに鼻を入れ、分散した電極にしっかりと接地した裸の背中を持つスニーンの位置に置きます。潤滑ゼリーで24ゲージのアンジオカテーテルを潤滑し、マウス尿道を通して優しくしっかりとアンギオカテーテルを挿入します。カテーテルが入り口で曲がった場合は、安定性を提供するためにカテーテルにガイドワイヤーを途中で挿入してください。
次いで、0.64ミリメートル固定コアストレートガイドワイヤーを1ミリメートル、血管カテーテルの端を1ミリメートル挿入します。単極ピンをガイドワイヤーに1秒間持ち、膀胱粘膜の電気刺激を可能にする。新鮮な無菌アンギオカテーテルを1 mLのリールロックシリンジに取り付け、前のステップで調製した最大200マイクロリットルのUCC細胞を引き出します。
ガイドワイヤーと血管カテーテルを尿道から取り出し、その後、それに取り付けられた細胞の注射器を持つ血管カテーテルを挿入します。マウスの膀胱に50マイクロリットルの細胞を注入し、細胞が膀胱壁に付着できるように、血管カテーテルを取り外す前に数秒待つ。最後に、イオブルランの鼻コーンと接地パッドからマウスを取り出し、苦痛の兆候の手順に従って1時間観察します。
CRCマウスモデルを作成するには、麻酔付き6-8週齢の男性NOD-SCIDマウスを、鼻とイゾフルランの鼻コーンと前肢に固定する解剖顕微鏡の下で、麻酔付きの6-8週の男性NOD-SCIDマウスをテープで固定し、安定性を確保します。小さなガーゼセクションのような小さなオブジェクトを尾の底部の下に置き、アヌスを上昇させ、見やすく、角度を改善します。湾曲した潤滑された鈍い先端鉗子を使用して肛門管を拡張し、遠位肛門および直腸粘膜を露出させ、便を除去する。
50マイクロリットルガラスシリンジに滅菌30ゲージの取り外し可能な針を接続します。前のステップで調製した腫瘍およびHK細胞懸濁液の10マイクロリットルを注射器に引き込む。肛門管の上の遠位直腸下粘膜に10マイクロリットルを注入し、骨盤腔に入らないようにします。
最後に、イオブルランの鼻コーンからマウスを取り出し、苦痛の兆候の手順に従って1時間観察します。いずれかのマウスモデルにおける原発腫瘍、肝臓および肺転移性負担を毎週監視するには、まず、マウスの重量を量る。150 mg/kg ルシフェリンを腹腔内に注入し、基板が体内で循環するまで5分待ちます。
鼻コーンに鼻を固定した生物発光イメージングシステムに麻酔マウスを置き、動物の腹側である対象領域が各画像のカメラに向かっていることを確認します。ルシファーゼ活性に対する毎週の至上位置の画像マウス。パラフィン埋め込まれた孤立した組織をスライスして染色した後、高出力顕微鏡を使用して観察します。
UCCマウスモデルでは、動物の83.3%が原発性腫瘍を発生させ、毎週の生物発光測定に基づいて時間依存的な原発腫瘍の増殖を示した。CRCマウスモデルでは、マウスの96.9%が原発性腫瘍を増殖させた。患者腫瘍に応じて、マウス腫瘍の増殖は、患者の臨床特性の違いを反映する異なる遅延期間を有していた。
ベシクル内モデルと直腸内モデルの両方で、腫瘍細胞注射は直交原発性腫瘍を生み出した。さらに、33.3%および53.1%のマウスにHK細胞を含むUCC細胞およびCRC細胞を植え付け、それぞれ遠方臓器転移を発症した。UCCモデルにおける異種移植片の組織病理学は、初代患者膀胱癌と比較した。
異種移植片の染色結果は、元の外科生検のものと同様であり、同様の組織形態を確認した。ヒト細胞増殖マーカーであるKi67に対する抗体は、増殖性が高く、成長が速いヒト腫瘍細胞を示す陽性核染色を示す。同様に、CRCモデルでは、H&E染色は異種移植片と患者腫瘍の間の建築の類似性を示す。
サイトケラチン20に対する抗体染色も、両方のCRCモデルにおいて同様の腫瘍増殖パターンを示した。これらの手順の鍵は、動物を優しく、しかししっかりと扱う方法です。安定した手で練習することは、安全にこれらの技術を実行し、最良の結果を達成するための最良の方法です。
これらのモデルが作られると、現在の薬物の組み合わせだけでなく、患者の臨床試験の前に新たに開発された治療法を含む、複数の異なる形態の癌療法をテストすることができます。がん細胞と針の両方の取り扱いは、その安全性だけでなく、最適な結果を達成するために経験豊富な人員によって行われるべきであることを覚えておくことが重要です。
