患者由来の異種移植片モデルと原細胞株は、医薬品開発の不可欠な部分となり、腫瘍生物学研究の開始と進行を行っています。患者由来の異種移植片モデルは、癌細胞の組織学的外観を維持し、腫瘍内不均一性を保持し、腫瘍微小環境の関連するヒト成分をよりよく反映する。彼のモデルは、ヒト癌の、そして伝統的な癌細胞株のより正確な表現のためのものであり、新しい抗癌療法の前臨床評価を改善する可能性を秘めている。
さらに、これらのモデルは、癌患者の異なるサブグループ間で分子特性または腫瘍シグネチャを比較するのに有用であり得る。NSGマウスは免疫不全マウスモデルとして推奨される。マウスの重度の免疫不全のために、すべての実験で無菌性を維持しなければならない。
無菌状態では、鉗子とはさみを使用して腫瘍組織を慎重に解剖し、それらをいくつかの小片にトリミングします。マウスを麻酔した後、両方の側部に1センチメートルの切開を行うために無菌はさみを使用してください。滅菌鉗子を使用して皮下組織を破壊する。
次に、腫瘍組織の一部をクリップし、深い部位に配置します。外科縫合針で皮下縫合糸によってインプラント領域を閉じる。ヨウ素で傷を殺菌する。
この後、胸骨の不順を維持しながら、マウスを空のケージにそっと置きます。彼らは目を覚まし、約3〜4分後に歩き始める必要がありますので、マウスに細心の注意を払ってください。手術を受けたマウスを手術を受けていないものから分離した新しいケージに入れる。
移植部位の触診によって腫瘍の大きさを評価し、週に2回、バーニエキャリパーでそれらを測定する。マウスを安楽死させた後、滅菌鉗子とはさみを使用して、マウスから腫瘍をゆっくりと分離する。腫瘍組織をDPBSで10センチ皿で洗います。
あなたは壊死領域、脂肪組織、血栓および結合組織を解剖し、除去するために鉗子およびはさみ。次に、カビを使用して腫瘍組織を最大厚さ1ミリメートルに切断する。腫瘍スライスをDPBSで10センチメートル皿で洗います。
ガラス化プロセスを開始するには、鉗子を使用してスライスをチューブV1に移し、4分間摂氏4度でインキュベートします。チューブをロールして反転させ、さらに4分間摂氏4度でインキュベートします。次に、V1溶液とスライスを10センチメートルの皿に注ぎ、鉗子を使ってスライスをチューブV2に移します。摂氏4度で4分間インキュベートします。
チューブをロールして簡単に反転させ、さらに4分間摂氏4度でインキュベートします。この後、V2溶液とスライスを10センチメートルの皿に注ぎます。チューブV3にスライスを移し、5分間摂氏4度でインキュベートします。
チューブをロールして反転させ、摂氏4度でさらに5分間インキュベートします。すべてのスライスがチューブの底に沈むことを確認します。いくつかのスライスが浮いたままの場合は、チューブを短時間ロールして反転し、すべてのスライスが完全に沈むまで摂氏4度でインキュベートします。
その後、V3溶液を注ぎ、10センチメートルの皿にスライスします。組織ホルダーを適切な長さに切り、滅菌ガーゼに置きます。スライスをホルダーに移します。
ホルダーをガーゼで包みます。鉗子を使用して、ホルダーを液体窒素に入れ、5分間インキュベートさせます。この後、極低温バイアルに組織情報をラベル付けします。
ティッシュスライスでホルダーをバイアルに移し、液体窒素に保存します。まず、切除された標本または採取したPDX組織から胃癌サンプルを切除する。氷の上に組織を置き、10センチメートルの無菌培養皿に移します。
壊死領域、脂肪組織、血栓、結合組織を除去するために鉗子とはさみを使用してください。ペニシリンとストレプトマイシンを含むDPBSを10センチメートル皿に入れて、腫瘍組織を一度洗います。次に、皿のふたの上に腫瘍を粉々に切ります。
各部分の最大厚さは1ミリメートルでなければなりません。1型コラゲターゼとトリプシン溶液の7ミリリットルを含む50ミリリットル遠心分離チューブに作品を移します。混合物を短時間渦液。
摂氏37度の水浴で30~40分間インキュベートし、5分ごとに水槽をボルテックスします。この後、10%FBSを添加したRPMI-1640培地の等量を加え、混合物を完全に渦巻く。40マイクロリットルフィルターをゆっくりと濾過して、この混合物を新しい50ミリリットル遠心管に移します。
遠心分離機は、室温で5〜7分間gの113〜163倍の速度で濾過する。この上清を慎重に取り除いてください。ペレットをPBSの5ミリリットルで洗い、上清を慎重に取り除きます。
ペレットが赤色の場合、赤血球が含まれる。500マイクロリットルの赤血球リシスバッファーでペレットを静かに再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。その後、PBSを5ミリリットル加えます。
室温で5〜7分間113〜163倍の速度で遠心分離機。上清を慎重に取り除き、培養液でペレットを再懸濁し、混合物を無菌10センチメートル皿に移します。5%の二酸化炭素で37°Cで培養をインキュベートし、2〜3日ごとに培地を血清含有培地に置き換えることを確認します。
本研究では、胃癌PDXモデルおよび原発細胞株が確立されている。第1世代の腫瘍は、後の世代よりもゆっくりと成長し、適切な大きさに達するまでに3週間以上かかると見られる。第一世代皮下腫瘍形成の成功率は80%以上であり、PDXモデルからの癌細胞の同一性は、H&E染色によってPDXモデルから確認される。
凍結保存腫瘍組織からの腫瘍形成の成功率は、約95%の腫瘍細胞が形態の違いによって容易に認識できることがわかる。原細胞は、顕微鏡下で2人の病理学者によって独立して認証される。さらに確認のために、H&E染色は、固定後の癌細胞形態を観察するために使用される。
原発細胞株の分離が成功した割合は約40%これらのモデルは、臨床結果の予測であることが示されており、マーカー同定、生物学的研究、および個別化された医療戦略による前臨床薬物評価に使用されている。
