We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

全ての実験手順は、シンシナティ小児研究財団の機関の動物委員会によって承認されました。 4ヶ月 - この研究のために、造血幹細胞は、2高齢のC57Bl / 6近交系マウスの骨髄から単離しました。リネージュ含む異なる表面メーカーとBMの染色後にFACSを用いて細胞選別、c-キット、SCA-1、のFlt3およびCD34は、LIN-SCA-1 +のc-kit +のFlt3に基づいてHSCの精製に使用した- CD34 -ゲーティング戦略標準プロトコルとして8の前に説明しました。 注意：いくつかの非常に毒性の強い化学薬品は、この手順の間に使用されています。これらは、吸入および皮膚接触によって有毒です。手袋や防護服を着用してください。これらの化学物質での作業中にヒュームフードで働いています。 1.細胞、固定、染色およびプリ埋め込み<ol><li>林を使用してソート万造血幹細胞（ - SCA-1 <suP&gt; +のc-kit +のFlt3 - CD34 -ゲーティング戦略。 LT-HSC集団）FACSを用いて10％ウシ胎児血清を600μlのイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブインチ</li><li>スイングアウトバケットと遠心機を用いて1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中で10分間千×gでソートされたHSCをスピンダウン。穏やかな吸引によって培地を除去し、各ステップでチューブに200μlの培地を残します。この段階では、細胞ペレットがチューブで目に見えないまま。 </li><li> 1時間1,9、室温（RT）で2倍固定溶液の0.2ミリリットルを追加することにより、細胞を固定。 <ol><li>使用前に固定溶液は新鮮なことを確認します。 1Xでは、溶液を、0.1Mカコジル酸緩衝液中の3％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒドで構成されています。 </li></ol></li><li>遠心スイングアウトバケットと遠心機を用いて30℃で10分間1,000×gでの細胞。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸緩衝液の600μlの細胞を洗浄遠心分離を用いて、遠心分離した後、チューブに200μlのバッファーを残します。 </li><li>カコジル酸緩衝液中にエバンスブルーを2mg / mlの溶液200μlを添加することによって、固定された細胞を染色し、室温で20分間インキュベートします。細胞は青色に着色されます。 </li><li>遠心分離を用いて、0.1Mカコジル酸緩衝液の600μlの3倍の細胞を洗浄し、チューブ内の各時間を200μlのバッファーを残します。 </li><li> 200μlの緩衝液中で細胞を再懸濁し、0.5 mlチューブに細胞懸濁液を転送します。テーブルトップ遠心機を用いて10分間1,000×gで遠心。今目に見える小さな細胞ペレットを乱すことなく静かにバッファを外し、チューブに50μlのバッファーを残します。 </li><li> 4％アガロース溶液15 mlのチューブに0.1 Mカコジル酸緩衝液5mlにアガロースを200mgに低融点を追加します。 100ミリリットルのガラス瓶に沸騰したお湯にチューブを転送することによって、アガロースを溶融し、使用するまでぬるま湯続けます。 </li><li>アガロース0.1 M cacodylaに溶解し、4％の低融点の200μLを加えますTEバッファー0.5ミリリットルチューブ中の細胞懸濁液に、すぐにテーブルトップ遠心機を用いて30℃で10分間千×gで遠心します。 </li><li>細胞は、遠心分離後の半固体アガロースに0.5ミリリットルチューブの底にペレット化していることを確認した後、すぐにアガロースを固化する20分間、4℃にチューブや氷を移します。このステップは、電子顕微鏡下での細胞の良好なクラスタのこのステップの結果に小さな目に見える細胞ペレットとして、非常に重要です。 </li><li>慎重に27 G針3,10を使用してバッファを含む35ミリメートルのプラスチックシャーレにチューブから細胞ペレットを含む固化したアガロースを転送します。 </li><li>メスで2ミリメートル - 約1の1片に細胞ペレットを含む固化したアガロースをトリミング。新しい1.5 mlチューブに細胞ペレットを含有するアガロース片を転送します。 </li><li>遠心分離することなく、ピペットを用いて緩衝液を添加し、除去することによって、0.1Mカコジル酸緩衝液600μlのを使用して3回 - 2を洗います。次のステップのために、細胞ペレットを含むこのアガロース片を使用してください。このステップでは、サンプルは、次のステップに移動する前に、4℃で一晩保存することができます。 </li></ol> 2.オスミウム酸染色法、脱水、埋め込み<ol><li>ピペットを用いてアガロース含む細胞ペレットに1.5mlチューブからカコジル酸緩衝液を除去します。 1％の四酸化オスミウム（のOsO 4）ヒュームフード内の溶液の1.0ミリリットルを追加し、4℃で1時間インキュベートします。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸緩衝液の600μlの3回洗浄し、キャップで20mlのガラスシンチレーションバイアルにサンプルを移します。 </li><li>脱水、浸透のためのサンプルを処理し、樹脂への埋め込み（ 例えば 、LX-112）6ウェルプレート中で、以下の溶液の連続変化しています。鉗子を用いて細胞ペレットアガロース片を移動します。 <ol><li>室温で15分間、25％エタノールで試料を浸します。 </li><li>室温で15分間、50％エタノールで試料を浸します。 </li><li> 75パーセントにサンプルを浸し15分間室温でエタノール。 </li><li>室温で15分間、95％エタノールで試料を浸します。 </li><li>二回、15分間、室温で100％エタノールで試料を浸します。 </li><li>エタノール中でサンプルを浸す：樹脂（3：1）室温で30分間。 </li><li>エタノール中でサンプルを浸す：樹脂（1：1）、室温で30分間。 </li><li>エタノール中でサンプルを浸す：樹脂（1：3）室温での30分間。 </li><li>二回、60分間、室温で純樹脂試料を浸します。 </li></ol></li><li>慎重にピンセットを用いてピラミッド先端形状のゴム型の底にサンプルを移し、金型を埋めるために、試料の上に、より純粋な樹脂を追加します。樹脂重合のための72時間、60℃でサンプルをインキュベートします。 </li><li>ゴム型をねじることによって金型から重合樹脂ピラミッドを削除します。先に7説明したように細胞の小さな黒いクラスタは、重合樹脂ピラミッドに見えるはずです。シアノアクリレートを用いた実装シリンダーに重合樹脂ピラミッドを取り付けます。 </li></ol><ol><li>カミソリの刃や超ミクロトームでブロックを搭載した後、ダイヤモンドナイフでピラミッドのブロックをトリム。トップとショート広い台形形状と互いにブロック並列の底部を作成し、均等に傾斜した側面を有します。ピラミッドのこの形状は、連続切片のために役立ちます。 </li><li>さらに、ダイヤモンドナイフで細胞ペレットの周りのブロックをトリミングし、細胞ペレットアガロース片の周りのプラスチック部分を削除します。 </li><li>ウルトラミクロトームを用いて1μmのセクションをカット。まつげツールと以前に7報告されているように金属ループツールを使用してスライドガラスに水上ボートから1μmのセクションを移動します。乾燥のためのホットプレート（37℃）にスライド移動スライド上の転送部。 </li><li> 0.22μmのフィルターを備えたシリンジを使用してセクションへのトルイジンブルー溶液の液滴を加え、3分間インキュベートします。蒸留水およびlでスライドをすすぎますらのセクションでは、乾燥させます。細胞の位置を特定するために光学顕微鏡で確認してください。 </li><li>ダイヤモンドナイフを使用して - （100 nmの70）超薄切片をカット。まつげのツールを用いてガラスシャーレに水ボートから200メッシュのグリッド上の3つのセクション - 2を移動します。 </li><li> 30分間のセクションを乾燥させるために30℃のホットプレートにセクションを持つグリッドを含むガラスシャーレを転送します。 </li><li>室温で10分間、1％酢酸ウラニルの液滴でグリッドを染色した後、蒸留水ですすぎ6 - 8回。 8回 - レイノルズとのステインは、6を室温で5分間、クエン酸鉛、蒸留水ですすいでください。セクションを乾燥させるために37℃のホットプレートにグリッドを含むガラスシャーレを転送します。 </li><li> 80 kVの7で、電子顕微鏡でセクションを分析します。 </li></ol>

<ol>
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著者らは、開示することは何もありません。

この方法では、脱水中に小さな細胞ペレットをローカライズするために埋め込むエバンスブルー染色し、アガロースを用いて樹脂の埋め込みやプロセスを区画することにより、低細胞数のTEM分析を可能にします。重要なことは、それが一緒に細胞塊を維持し、データの定量化のための複数のセルを検査することが望ましい細胞の超構造を保存します。 TEM試験では、細胞の数百万を含む細胞ペレットは、多くの場合、多数のセルからデータを得るために、アガロース/ゼラチンマトリックス中および洗浄、脱水及び浸透のための効率的な埋め込みのために必要とされます。研究者らは、希少なサンプル/低細胞数のTEM分析のためにBSA-ビスアクリルアミド重合樹脂、薄い支持体上の単層の染色、またはサイトスピンで4-6を細胞懸濁液の固定化を採用しています。しかし、それはマトリックス内にあるため、細胞のまばらな分布のTEM下で細胞をローカライズし、カットする退屈な仕事のままであり、拡散と、多くの場合、切片の前に再埋め込みを必要とサイトスピン調製中の細胞間の切断に対する細胞形態の可能な変更、。さらに、単層は11を区画するためにローカライズするために依然として厳しいです。このように、低くても細胞数の希少生物学的サンプルから細胞ペレットは、TEM分析1のためにはるかに簡単です。 この方法は、限られたサンプルからの定性的および定量的な超構造解析の面で以前公開された方法4,5に重要な利点を表しています。一緒に、このプロトコルは、TEMは、定性および定量データ分析を可能にする低細胞数からサンプル処理が容易になりエバンスブルーを使用して、TEM用の細胞ペレットをローカライズするための効率的な方法を説明します。典型的に、TEMのためのサンプル調製が原因サンプル処理Fの複数のステップの、通常光学顕微鏡のために必要とされるものよりも、細胞の多数を必要としますTEMと右の位置1,10に切断するためのセルブロックの正しい向きか。 後固定オスミウム酸染色法は、特に膜およびグリコーゲン粒子のそれらの酢酸ウラニル、タンパク質の比較的非特異的な染色で電子顕微鏡9、さらに支持染色の下で、画像内のより良いコントラストを提供することが知られており、染色クエン酸鉛れます膜、核酸およびグリコーゲン。しかし、オスミウム酸染色法が原因黒ずみを区画し、マトリックス中のサンプル損失の可能性が高いにBSA-BAで事前に埋め込んだ後、懸濁液中の希少な生物学的サンプルを用いて実行することはほとんど不可能です。従って、電子顕微鏡写真の品質は以前の研究4,9で妥協しました。ここオスミウム酸染色法は、アガロースの色の変化が最小限であると細胞ペレットの黒ずみにつながりました。このように、本プロトコルは、TEMイムで良好なコントラストを提供するために、アガロースで事前に埋め込んだ後オスミウム酸染色法を可能にします年齢。 細胞クラスターは、この方法を使用して電子顕微鏡で分析するのは非常に容易でした。エバンスブルーによる前染色は、サブ細胞小器官の細胞の詳細に影響を与えることなく、試料調製中に小さな細胞ペレットをローカライズするのに役立ちました。この方法は、正常、低細胞数からTEM分析を行うための試料調製のための別のアプローチを提供します。 （ - 8ミクロン5）この方法では、TEM分析は、効果的に小型の細胞を用いて行きました。したがって、このアプローチは、容易にそのような線維芽細胞および内皮細胞のような、より大きな細胞のより低い細胞数（〜1,000細胞）で採用することができます。エバンスブルーは、本研究では、サブ細胞小器官の細胞の詳細に影響を及ぼさなかったが、細胞数が少ない免疫金電子顕微鏡用のエバンスブルーの使用がテストされていません。 一緒に、低い細胞数のTEM調査を実行するための試料調製のための効率的な方法が記載されています。 TEMの研究はcriticaを明らかにするために必要とされます細胞の形態と超構造上リットル情報。したがって、超構造情報は、多くの場合、様々な希少な細胞集団に欠落しています。この代替と試料調製のための新規のアプローチは、任意の希少な細胞集団からTEM研究を行うために役立つであろう。さらに、この方法は、セルクラスタの分析から定性的および定量的データを可能にします。電子顕微鏡は、細胞の超構造と組織の卓越した詳細を提供していますように、この方法は、キーが、希少細胞集団上の多くの生物学的プロセスを理解するのに非常に有用であろう。

細胞の超構造的およびサブオルガネラ詳細は主に組織または細胞ペレット1,2の透過型電子顕微鏡（TEM）の研究によって明らかにされています。組織の固体片を容易に電子顕微鏡研究のために利用することができます。しかし、TEMは、懸濁液中の細胞に1,3を分析した細胞の数百万、厳しい状況が続くと高い細胞数を必要とする、 すなわち 。このため、懸濁液中の希少な細胞集団の超構造解析は、 例えば、造血幹細胞（HSC）は、容易に評価されません。サイトスピンまたは単層のアプローチを使用して、不足して試料からのTEM解析のために複数の試みは限られた数の細胞から重要な定量的なデータを取得するために失敗します。このように、高い細胞数の要件は、希少な細胞集団の細胞内超微細詳細を理解するために、この強力なツールの使用を制限します。 セルの数が限られているTEM研究のためのキーの制限懸濁液中のsが処理のために、細胞の局在であり、従って、特に小さいサイズの制限された細胞由来のTEM調査は困難なままです。いくつかの代替的なアプローチは、この制限に対抗するために採用されている：細胞懸濁液のBSA /ビスアクリルアミド（BSA-BA）媒介重合、細胞の染色を染料でカバースリップを含む薄いフィルム支持体上にそれらが表示されるように、 およびTEMは、サイトスピン調製物4-6から分析します。非常に少数の細胞が超切片後の節で見たようしかし、非常に限られた成功は、達成されました。細胞単層は、切片のために固化したゲル中の大部分が見えないままなので、スパース細胞を同定するの主要な課題は解消されません。さらに、細胞のサイトスピン調製を伴う細胞拡散、細胞構造の脆弱性への細胞の組織を変化させることができます。したがって、これらの固有の欠点は、より稀な細胞集団からのTEM調査を実行するための新規なアプローチを正当一貫性。この問題を克服するために、我々は、まれな細胞集団7からTEM研究のための新規かつ代替サンプル調製方法を記載しています。 ここでは、一貫性の定性的および定量的な結果と希少な生物学的サンプルからTEMを実行するための効率的なサンプル調製プロトコルを報告しています。エバンスブルー染色は、そうでなければ見えないままであったであろう数が少ない細胞、 すなわち 、万骨髄の造血幹細胞および前駆細胞から小さな細胞ペレットを局在化するために固定した後に行われた、そしてペレットを脱水し、樹脂包埋工程の前に、アガロースに包埋しました。この方法は、一緒に細胞をクラスタ化し、超微細構造と（林として識別- SCA-1 +のc-kit +のFlt3 - CD34 - ; HSC）造血幹細胞の細胞内、組織の効率的な解析が可能、稀0.2から0.5パーセントの細胞集団を骨髄インチこの実験的なプロトコールは、超構造研究を行うのに有用であると多くのまれではあるが非常に重要な集団の定量的な結果を得ることができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1096">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">15713</td>
			<td style="width:440px;">CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td>16350</td>
			<td>CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Cacodyladate buffer&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">12300</td>
			<td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4&#176;C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evans Blue&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">E-2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low melting agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:113px;">A-5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Osmium tetraoxide&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">19130</td>
			<td>1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LX-112 Embedding Kits (LADD&#174;)</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21340</td>
			<td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NMA (Nadic methyl anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21310</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Uranyl acetate (EM Stain I)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">8072820</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ATCC</td>
			<td style="width:113px;">30-2005</td>
			<td>composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramid tip mold&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cylinders</td>
			<td style="width:216px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-microtome&#160;</td>
			<td style="width:216px;">(Leica EM UC7)</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">200 mesh grids (nikil)</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">G-200 Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi model H-7650&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Image capture engine software</td>
			<td>AMT-600&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm plastic petri dishes</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">72588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials&#160;</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>03-337-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eyelash tool</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal Loop tool&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

透過型電子顕微鏡（TEM）は、細胞、組織及び微細構造の詳細を提供します。しかしながら、このような造血幹細胞（HSC）などの希少細胞集団、懸濁液中で特に細胞のTEM分析は、によりサンプル調製時の高い細胞数の要件に制限されたままです。そこ希少試料からのTEM分析のためのいくつかのサイトスピンまたは単層のアプローチがありますが、これらのアプローチは、限られた数の細胞から重要な定量的なデータを取得するために失敗します。ここでは、TEM研究における試料調製のための代替的なおよび新規なアプローチは、定量的な分析を可能にする希少細胞集団のために記載されています。 比較的低い細胞数、 すなわち10,000のHSCは、正常通常はTEM研究のために使用される細胞の数百万人に比べTEM分析に使用しました。具体的には、エバンスブルー染色は、小さな細胞画素を可視化するために、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（PFA-GA）固定後に実施しましたアガロースに包埋促進する、しましょう。多数の細胞のクラスターは、超薄切片において観察されました。細胞はよく保存形態を有し、かつゴルジ複雑で、いくつかのミトコンドリアの超微細構造の詳細が表示されていました。この効率的で、簡単で再現可能なプロトコールは、低細胞数からの試料調製を可能にし、限られた生物学的サンプルから稀な細胞集団の定性的および定量的なTEM分析のために使用することができます。

セルの数が少ないからTEM分析を行うための試料調製のための効率的かつ一貫性のあるプロトコルが記載されています。エバンスブルーおよび0.5 mlのマイクロ遠心チューブに細胞の移動と定着後の染色は小さな細胞ペレット7を視覚化する助けました。アガロース中の四酸化オスミウムとオスミウム酸染色法は、脱水および埋め込み時に暗い細胞ペレットを容易に検出につながりました。 小さな細胞ペレットを含むブロックから半薄切片は、一緒になった （ 図1A及び1B）を多数の細胞のクラスターが確認されました。超薄切片は、細胞クラスタ領域から切断し、電子顕微鏡（ 図1C）で分析しました。これらの細胞の形態および超構造がよく（ 図1D）保存しました。個々の細胞の電子顕微鏡写真は、細胞内での高詳細を示しました超構造（ 図1E）。また、高倍率（50,000X）の画像がよく保存された構造と、そのようなミトコンドリア（ 図1F）などのサブ細胞小器官の完全性を示しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54724/54724fig1.jpg" /> 図1： 画像解析の下では光と電子顕微鏡。 （A）光顕微鏡下で厚さ1μmのトルイジンブルー染色切片の代表的な視野の低倍率画像。（B）を1μm厚切片のトルイジンブルー染色した後、クラスタ内の細胞の無傷の形態を示す光学顕微鏡像。 （C）酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した後、電子顕微鏡で観察された細胞クラスタの概要フィールド（D）単LT-HSC電子顕微鏡（E）より高いmagnifHSPCからミトコンドリアの細胞内構造を示すHSCのicationイメージ。（F）より高い倍率画像。スケールバー：A / B、100ミクロン; C、10ミクロン; D、2ミクロン; E / F、500ナノメートル。 &#160; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54724/54724fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM分析のための低細胞数とサンプル調製のための代替的アプローチ

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K ビュー.  Cincinnati Children’s Research Foundation. Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis. 

ビデオ: An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides vital information on bone turnover or bone formation and resorption. This has tremendous importance in a variety of clinical and research applications. It yields beautiful images1 and allows for techniques such as fluorochrome assessment and histomorphometry2. Fluorochrome analysis is a technique where fluorescent dyes that bind to calcium are injected at a particular time point, which allows for quantification of the amount of mineralisation at that given time. Histomorphometry is a process of bone quantification at the microscopic level. 
Performing undecalcified bone histology is technically challenging, particularly with large size specimens. It requires variations in technique from those used in standard paraffin embedded histology. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them. Specimen preparation, fixation and processing are achieved with a manner similar to other soft tissues, however due to the density and lower permeability of bone considerably longer fixation and processing times are required, often taking several weeks. Embedding is achieved using a supporting medium with similar or equal hardness and density to the bone such as methacrylate- based resins, but unlike paraffin infiltration and embedding, this is an irreversible step. Sectioning can be achieved by grinding which produces a thicker section, which is optimal for studies such as fluorochrome analysis. This is best achieved using a diamond blade on a macrotome. Alternatively, thinner sections can be produced for light microscopy and this is achieved using a sledge microtome with a very sharp blade. The sledge microtome provides the additional strength and stability required for large, hard blocks. Resin embedded sections can be stained with a variety of stains, which are demonstrated.

Undecalcified bone histology provides important information for a variety of clinical and research applications. It is technically challenging, particularly with large size specimens. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them.

組織学、組織形態計測および蛍光色素分析のためのUndecalcified骨の準備

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

生物学

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

質量サイトメトリー分析のための試料調製

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

気孔テープ剥離: 細胞試料の調製法の改良

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

眼微小循環の質量分析法を用いたプロテオミクス解析の前処理

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...