Name: an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
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We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

全ての実験手順は、シンシナティ小児研究財団の機関の動物委員会によって承認されました。 4ヶ月 - この研究のために、造血幹細胞は、2高齢のC57Bl / 6近交系マウスの骨髄から単離しました。リネージュ含む異なる表面メーカーとBMの染色後にFACSを用いて細胞選別、c-キット、SCA-1、のFlt3およびCD34は、LIN-SCA-1 +のc-kit +のFlt3に基づいてHSCの精製に使用した- CD34 -ゲーティング戦略標準プロトコルとして8の前に説明しました。 注意：いくつかの非常に毒性の強い化学薬品は、この手順の間に使用されています。これらは、吸入および皮膚接触によって有毒です。手袋や防護服を着用してください。これらの化学物質での作業中にヒュームフードで働いています。 1.細胞、固定、染色およびプリ埋め込み<ol><li>林を使用してソート万造血幹細胞（ - SCA-1 <suP&gt; +のc-kit +のFlt3 - CD34 -ゲーティング戦略。 LT-HSC集団）FACSを用いて10％ウシ胎児血清を600μlのイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブインチ</li><li>スイングアウトバケットと遠心機を用いて1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中で10分間千×gでソートされたHSCをスピンダウン。穏やかな吸引によって培地を除去し、各ステップでチューブに200μlの培地を残します。この段階では、細胞ペレットがチューブで目に見えないまま。 </li><li> 1時間1,9、室温（RT）で2倍固定溶液の0.2ミリリットルを追加することにより、細胞を固定。 <ol><li>使用前に固定溶液は新鮮なことを確認します。 1Xでは、溶液を、0.1Mカコジル酸緩衝液中の3％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒドで構成されています。 </li></ol></li><li>遠心スイングアウトバケットと遠心機を用いて30℃で10分間1,000×gでの細胞。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸緩衝液の600μlの細胞を洗浄遠心分離を用いて、遠心分離した後、チューブに200μlのバッファーを残します。 </li><li>カコジル酸緩衝液中にエバンスブルーを2mg / mlの溶液200μlを添加することによって、固定された細胞を染色し、室温で20分間インキュベートします。細胞は青色に着色されます。 </li><li>遠心分離を用いて、0.1Mカコジル酸緩衝液の600μlの3倍の細胞を洗浄し、チューブ内の各時間を200μlのバッファーを残します。 </li><li> 200μlの緩衝液中で細胞を再懸濁し、0.5 mlチューブに細胞懸濁液を転送します。テーブルトップ遠心機を用いて10分間1,000×gで遠心。今目に見える小さな細胞ペレットを乱すことなく静かにバッファを外し、チューブに50μlのバッファーを残します。 </li><li> 4％アガロース溶液15 mlのチューブに0.1 Mカコジル酸緩衝液5mlにアガロースを200mgに低融点を追加します。 100ミリリットルのガラス瓶に沸騰したお湯にチューブを転送することによって、アガロースを溶融し、使用するまでぬるま湯続けます。 </li><li>アガロース0.1 M cacodylaに溶解し、4％の低融点の200μLを加えますTEバッファー0.5ミリリットルチューブ中の細胞懸濁液に、すぐにテーブルトップ遠心機を用いて30℃で10分間千×gで遠心します。 </li><li>細胞は、遠心分離後の半固体アガロースに0.5ミリリットルチューブの底にペレット化していることを確認した後、すぐにアガロースを固化する20分間、4℃にチューブや氷を移します。このステップは、電子顕微鏡下での細胞の良好なクラスタのこのステップの結果に小さな目に見える細胞ペレットとして、非常に重要です。 </li><li>慎重に27 G針3,10を使用してバッファを含む35ミリメートルのプラスチックシャーレにチューブから細胞ペレットを含む固化したアガロースを転送します。 </li><li>メスで2ミリメートル - 約1の1片に細胞ペレットを含む固化したアガロースをトリミング。新しい1.5 mlチューブに細胞ペレットを含有するアガロース片を転送します。 </li><li>遠心分離することなく、ピペットを用いて緩衝液を添加し、除去することによって、0.1Mカコジル酸緩衝液600μlのを使用して3回 - 2を洗います。次のステップのために、細胞ペレットを含むこのアガロース片を使用してください。このステップでは、サンプルは、次のステップに移動する前に、4℃で一晩保存することができます。 </li></ol> 2.オスミウム酸染色法、脱水、埋め込み<ol><li>ピペットを用いてアガロース含む細胞ペレットに1.5mlチューブからカコジル酸緩衝液を除去します。 1％の四酸化オスミウム（のOsO 4）ヒュームフード内の溶液の1.0ミリリットルを追加し、4℃で1時間インキュベートします。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸緩衝液の600μlの3回洗浄し、キャップで20mlのガラスシンチレーションバイアルにサンプルを移します。 </li><li>脱水、浸透のためのサンプルを処理し、樹脂への埋め込み（ 例えば 、LX-112）6ウェルプレート中で、以下の溶液の連続変化しています。鉗子を用いて細胞ペレットアガロース片を移動します。 <ol><li>室温で15分間、25％エタノールで試料を浸します。 </li><li>室温で15分間、50％エタノールで試料を浸します。 </li><li> 75パーセントにサンプルを浸し15分間室温でエタノール。 </li><li>室温で15分間、95％エタノールで試料を浸します。 </li><li>二回、15分間、室温で100％エタノールで試料を浸します。 </li><li>エタノール中でサンプルを浸す：樹脂（3：1）室温で30分間。 </li><li>エタノール中でサンプルを浸す：樹脂（1：1）、室温で30分間。 </li><li>エタノール中でサンプルを浸す：樹脂（1：3）室温での30分間。 </li><li>二回、60分間、室温で純樹脂試料を浸します。 </li></ol></li><li>慎重にピンセットを用いてピラミッド先端形状のゴム型の底にサンプルを移し、金型を埋めるために、試料の上に、より純粋な樹脂を追加します。樹脂重合のための72時間、60℃でサンプルをインキュベートします。 </li><li>ゴム型をねじることによって金型から重合樹脂ピラミッドを削除します。先に7説明したように細胞の小さな黒いクラスタは、重合樹脂ピラミッドに見えるはずです。シアノアクリレートを用いた実装シリンダーに重合樹脂ピラミッドを取り付けます。 </li></ol><ol><li>カミソリの刃や超ミクロトームでブロックを搭載した後、ダイヤモンドナイフでピラミッドのブロックをトリム。トップとショート広い台形形状と互いにブロック並列の底部を作成し、均等に傾斜した側面を有します。ピラミッドのこの形状は、連続切片のために役立ちます。 </li><li>さらに、ダイヤモンドナイフで細胞ペレットの周りのブロックをトリミングし、細胞ペレットアガロース片の周りのプラスチック部分を削除します。 </li><li>ウルトラミクロトームを用いて1μmのセクションをカット。まつげツールと以前に7報告されているように金属ループツールを使用してスライドガラスに水上ボートから1μmのセクションを移動します。乾燥のためのホットプレート（37℃）にスライド移動スライド上の転送部。 </li><li> 0.22μmのフィルターを備えたシリンジを使用してセクションへのトルイジンブルー溶液の液滴を加え、3分間インキュベートします。蒸留水およびlでスライドをすすぎますらのセクションでは、乾燥させます。細胞の位置を特定するために光学顕微鏡で確認してください。 </li><li>ダイヤモンドナイフを使用して - （100 nmの70）超薄切片をカット。まつげのツールを用いてガラスシャーレに水ボートから200メッシュのグリッド上の3つのセクション - 2を移動します。 </li><li> 30分間のセクションを乾燥させるために30℃のホットプレートにセクションを持つグリッドを含むガラスシャーレを転送します。 </li><li>室温で10分間、1％酢酸ウラニルの液滴でグリッドを染色した後、蒸留水ですすぎ6 - 8回。 8回 - レイノルズとのステインは、6を室温で5分間、クエン酸鉛、蒸留水ですすいでください。セクションを乾燥させるために37℃のホットプレートにグリッドを含むガラスシャーレを転送します。 </li><li> 80 kVの7で、電子顕微鏡でセクションを分析します。 </li></ol>

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	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

この方法では、脱水中に小さな細胞ペレットをローカライズするために埋め込むエバンスブルー染色し、アガロースを用いて樹脂の埋め込みやプロセスを区画することにより、低細胞数のTEM分析を可能にします。重要なことは、それが一緒に細胞塊を維持し、データの定量化のための複数のセルを検査することが望ましい細胞の超構造を保存します。 TEM試験では、細胞?...

細胞の超構造的およびサブオルガネラ詳細は主に組織または細胞ペレット1,2の透過型電子顕微鏡（TEM）の研究によって明らかにされています。組織の固体片を容易に電子顕微鏡研究のために利用することができます。しかし、TEMは、懸濁液中の細胞に1,3を分析した細胞の数百万、厳しい状況が続くと高い細胞数を必要とする、 すなわち 。このため、懸濁液中の希少な細胞集団の超構造解析は、 例えば、造血幹細胞（HSC）は、容易に評価されません。サイトスピンまたは単層のアプローチを使用して、不足して試料からのTEM解析のために複数の試みは限られた数の細胞から重要な定量的なデータを取得するために失敗します。このように、高い細胞数の要件は、希少な細胞集団の細胞内超微細詳細を理解するために、この強力なツールの使用を制限します。 セルの数が限られているTEM研究のためのキーの制限懸濁液中のsが処理のために、細胞の局在であり、従って、特に小さいサイズの制限された細胞由来のTEM調査は困難なままです。いくつかの代替的なアプローチは、この制限に対抗するために採用されている：細胞懸濁液のBSA /ビスアクリルアミド（BSA-BA）媒介重合、細胞の染色を染料でカバースリップを含む薄いフィルム支持体上にそれらが表示されるように、 およびTEMは、サイトスピン調製物4-6から分析します。非常に少数の細胞が超切片後の節で見たようしかし、非常に限られた成功は、達成されました。細胞単層は、切片のために固化したゲル中の大部分が見えないままなので、スパース細胞を同定するの主要な課題は解消されません。さらに、細胞のサイトスピン調製を伴う細胞拡散、細胞構造の脆弱性への細胞の組織を変化させることができます。したがって、これらの固有の欠点は、より稀な細胞集団からのTEM調査を実行するための新規なアプローチを正当一貫性。この問題を克服するために、我々は、まれな細胞集団7からTEM研究のための新規かつ代替サンプル調製方法を記載しています。 ここでは、一貫性の定性的および定量的な結果と希少な生物学的サンプルからTEMを実行するための効率的なサンプル調製プロトコルを報告しています。エバンスブルー染色は、そうでなければ見えないままであったであろう数が少ない細胞、 すなわち 、万骨髄の造血幹細胞および前駆細胞から小さな細胞ペレットを局在化するために固定した後に行われた、そしてペレットを脱水し、樹脂包埋工程の前に、アガロースに包埋しました。この方法は、一緒に細胞をクラスタ化し、超微細構造と（林として識別- SCA-1 +のc-kit +のFlt3 - CD34 - ; HSC）造血幹細胞の細胞内、組織の効率的な解析が可能、稀0.2から0.5パーセントの細胞集団を骨髄インチこの実験的なプロトコールは、超構造研究を行うのに有用であると多くのまれではあるが非常に重要な集団の定量的な結果を得ることができます。

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>15713</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>16350</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Cacodyladate buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 &amp;deg;C. &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td></tr><tr><td>Evans Blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Low melting agarose&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>19130</td><td>1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; stock, &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LX-112 Embedding Kits (LADD&amp;reg;)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadic methyl anhydride)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Uranyl acetate (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>composition: NaCl, NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Pyramid tip mold&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>mounting cylinders</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtome&amp;nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mesh grids (nikil)</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>Hitachi model H-7650&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image capture engine software</td><td>AMT-600&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastic Petri dishes</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eyelash tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal Loop tool&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

透過型電子顕微鏡（TEM）は、細胞、組織及び微細構造の詳細を提供します。しかしながら、このような造血幹細胞（HSC）などの希少細胞集団、懸濁液中で特に細胞のTEM分析は、によりサンプル調製時の高い細胞数の要件に制限されたままです。そこ希少試料からのTEM分析のためのいくつかのサイトスピンまたは単層のアプローチがありますが、これらのアプローチは、限られた数の細胞から重要な定量的なデータを取得するために失敗します。ここでは、TEM研究における試料調製のための代替的なおよび新規なアプローチは、定量的な分析を可能にする希少細胞集団のために記載されています。 比較的低い細胞数、 すなわち10,000のHSCは、正常通常はTEM研究のために使用される細胞の数百万人に比べTEM分析に使用しました。具体的には、エバンスブルー染色は、小さな細胞画素を可視化するために、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（PFA-GA）固定後に実施しましたアガロースに包埋促進する、しましょう。多数の細胞のクラスターは、超薄切片において観察されました。細胞はよく保存形態を有し、かつゴルジ複雑で、いくつかのミトコンドリアの超微細構造の詳細が表示されていました。この効率的で、簡単で再現可能なプロトコールは、低細胞数からの試料調製を可能にし、限られた生物学的サンプルから稀な細胞集団の定性的および定量的なTEM分析のために使用することができます。

セルの数が少ないからTEM分析を行うための試料調製のための効率的かつ一貫性のあるプロトコルが記載されています。エバンスブルーおよび0.5 mlのマイクロ遠心チューブに細胞の移動と定着後の染色は小さな細胞ペレット7を視覚化する助けました。アガロース中の四酸化オスミウムとオスミウム酸染色法は、脱水および埋め込み時に暗い細胞ペレッ?...

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An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM分析のための低細胞数とサンプル調製のための代替的アプローチ

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K ビュー.  Cincinnati Children’s Research Foundation. Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis. 

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Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these stressors are combined there may be synergistic effects that enable unique microstructural evolution mechanisms to activate. Understanding of these mechanisms is necessary for the input and refinement of predictive models and critical for engineering of next generation materials. The basic physics and underlying mechanisms require advanced tools to be investigated. The in situ ion irradiation transmission electron microscope (I&#179;TEM) is designed to explore these principles.
To quantitatively probe the complex dynamic interactions in materials, careful preparation of samples and consideration of experimental design is required. Particular handling or preparation of samples can easily introduce damage or features that obfuscate the measurements. There is no one correct way to prepare a sample; however, many mistakes can be made. The most common errors and things to consider are highlighted within. The I&#179;TEM has many adjustable variables and a large potential experimental space, therefore it is best to design experiments with a specific scientific question or questions in mind.
Experiments have been performed on large number of sample geometries, material classes, and with many irradiation conditions. The following are a subset of examples that demonstrate unique in situ capabilities utilizing the I3TEM. Au nanoparticles prepared by drop casting have been used to investigate the effects of single ion strikes. Au thin films have been used in studies on the effects of multibeam irradiation on microstructure evolution. Zr films have been exposed to irradiation and mechanical tension to examine creep. Ag nanopillars were subjected to simultaneous high temperature, mechanical compression, and ion irradiation to study irradiation induced creep as well. These results impact fields including: structural materials, nuclear energy, energy storage, catalysis, and microelectronics in space environments.

Sample preparation techniques are outlined with specific considerations for in situ ion irradiation TEM experiments. Ion species, energy, and fluence are discussed with methods for how to select and compute them. Finally, procedures for conducting an experiment are described and accompanied by the representative results.

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these ...

工学

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers of multi-layered samples. This removal of layers prior to plunge freezing can aid in reducing sample thickness to a level suitable for cryo-EM data collection, improving sample flatness, and facilitating image processing. The peel-blot technique allows for the separation of multilamellar membranes into single layers, of layered 2D crystals into individual crystals, and of stacked, sheet-like structures of soluble proteins to likewise be separated into single layers. The high sample thickness of these types of samples frequently poses insurmountable problems for cryo-EM data collection and cryo-EM image processing, especially when the microscope stage must be tilted for data collection. Furthermore, grids of high concentrations of any of these samples can be prepared for efficient data collection since sample concentration prior to grid preparation can be increased and the peel-blot technique adjusted to result in a dense distribution of single-layered specimen.

The peel-blot technique is a cryo-EM grid preparation method that allows for the separation of multilayered and concentrated biological samples into single layers to reduce thickness, increase sample concentration, and facilitate image processing.

ピールブロット法:多層または濃縮された生物学的サンプルから単層を分離するクライオEMサンプル調製法

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

生化学

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

神経科学の TEM セクションをサンプリングの公平なアプローチ

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

神経科学

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

生物学

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

<meta charset="utf8"></head><body>TEM用のレチナールオルガノイドサンプル調製のための最適化されたプロトコール

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:TEMを使用した成熟Retinalオルガノイドのシナプス超微細構造の解析

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

TEM分析のための低細胞数とサンプル調製のための代替的アプローチ

要約

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Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

ピールブロット法:多層または濃縮された生物学的サンプルから単層を分離するクライオEMサンプル調製法

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

神経科学の TEM セクションをサンプリングの公平なアプローチ

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備