この作品は、癌研究のオンタリオ研究所（＃08NOV230）、イノベーションのためのカナダ財団（＃13199）、前立腺がんカナダ、ヤンセン腫瘍学、ロンドンリージョナルがんプログラム、およびジョンとドナブリストルからドナーの支援を通じてからの補助金によって支えられて（ALA）は、ロンドン健康科学財団。 LELは、フレデリック·バンティングとチャールズベストカナダ大学院奨学金博士賞でサポートされています。 α-リノレン酸は、CIHR新しい研究者賞と研究とイノベーションのオンタリオ州省か​​らの早期リサーチャー賞でサポートされています。

本稿で説明したすべてのヒトでの研究は、ウェスタン大学の人間研究倫理委員会によって承認されたプロトコルの下で実施した。すべての動物実験は、ウェスタン大学の動物への使用小委員会によって承認されたプロトコルの下で、動物ケアカナダ評議会の勧告に従って行った。 1。 CSSを使用して患者血液サンプルから標準、CTC列挙 1。準備インストゥルメントの処理のための人間の血液サンプル採取と準備<ol><li>標準的な無菌瀉血技法を使用して、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および独自の細胞保存剤を含有する（以下、CTC防腐チューブともいう）を、10ml CellSaveチューブにヒト血液8.0mlの最小を描く。血液の凝固を防ぐために、チューブの5倍を反転します。サンプルはすぐに処理されるか、最大96時間室温で保存することができる。 </li><li>リムーバブル冷蔵庫から電子のCSS試薬およびそれらを使用する前に室温に温める。 </li><li>使い捨ての10ミリリットルピペットや自動分注器を使用して、CTCの防腐管からの血液7.5ミリリットルを収集し、徐々に適切にラベル作成機器の処理チューブに血液を分注する。 </li><li>各サンプルに希釈緩衝液6.5ミリリットルを追加します。サンプル5X転倒混和する。 「オフ」の位置にブレーキをかけながら10分間800×gで遠心分離サンプル。処理のためにシステムにすべての患者サンプルをロードするための準備機器で画面上の指示に従ってください。サンプルは、準備の1時間以内に処理されなければならない。 </li></ol> 2。準備インストゥルメントの処理のための制御の準備<ol><li>優しくコントロールバイアルをボルテックスし、混合することが5倍に反転。 </li><li>慎重にコントロールバイアルからキャップを外し、キャップを外し、バイアルの上に反転準備計器処理チューブを配置します。 1迅速な運動では、反転バイアルを制御し、処理チューブに内容物を注ぐ。反転しながら、ゆっくりと残りの内容物を放出するために、制御バイアルの側面をフリック。 </li><li>慎重に、処理チューブから反転制御バイアルを取り外し、液体が失われないことを保証し、脇に置きます。千μLピペットを用いて、処理チューブにバイアル蓋と静かにピペットから、残りの内容を収集します。 </li><li>処理のためのシステムにコントロールをロードするための準備機器で画面上の指示に従ってください。 </li></ol> 3。分析計測器上のサンプルのスキャン<ol><li>システムからすべてのサンプルをアンロードする準備機器で画面上の指示に従ってください。ゆるく各磁気デバイスカートリッジにキャップをし、カートリッジの端に貼り付けられている任意の泡を解放するために手や実験台を用いた磁気デバイスをタップします。すべての気泡が除去されていると、しっかりと私は、カートリッジにキャップを平らな磁気デバイスを置き、室温で少なくとも20分間、暗所ncubate。サンプルは準備の24時間以内にスキャンする必要があります。 </li><li>分析装置の電源を入れ、ランプを初期化します。一回（15分〜）温め、分析機器へのシステム検証カートリッジをロードし、QCテスト ] タブを選択します。必要な品質管理対策を行うために、画面上の指示に従ってください。 </li><li>分析装置にサンプルをロードして、 患者のテスト ] タブを選択します。製造器具からすべての保存された情報が表示されます。サンプルのスキャンを初期化するために、開始をクリックします。システムは、磁気デバイスカートリッジに粗い焦点およびエッジ検出を実行する。 </li><li>方向キーを使用して、必要に応じてすべてのエッジを調整します。選択して受け入れます 。システムは、ファインフォーカスを実行し、サンプルのスキャンを開始します。 </li><li>結果をスキャンし、以下のような制御は、高（CK + DAでスパイク細胞について定義された基準を使用して検証する必要がありますPI + CD45 - APC +）、低（CK + DAPI + CD45 - FITC +）濃度。結果をスキャンして、次の患者のサンプルは、定義されたCTCの基準（CK + DAPI + CD45 - ）を使用して収集したCTCのために見直すべきである。 </li></ol> 2。 CSSを使用してユーザー定義マーカーのCTC特性評価 1。ユーザー定義のマーカーとインストゥルメントの初期化の準備<ol><li>作業濃度は、試料に加えた後、抗体の濃度であり、ストック濃度は、抗体の濃度である以下の式を用いて、標識試薬カップに所望の濃度にボンド一次抗体希釈液を用いて目的の抗体を希釈試薬カップ。複数のサンプルについては、 表1に記載したように、抗体のボリュームを調整する。試薬カートリッジとLの位置1に標識試薬カップを置くCSSにカートリッジをOAD。 ストック濃度=（作用濃度X 850μL）/ 150μL </li><li> 、採血試料を作製し、CSSのプロトコルを使用して患者血液サンプルから標準、CTC列挙上記で説明したように、準備測定器をロードします。準備機器によって要求されたら、カスタムマーカー追加を有効にするには、[ユーザーは、アッセイを定義しました 。入力マーカー名および[保存]を選択します。サンプルは、機器にロードされるように、オペレータは、必要に応じていいえを選択するかによって、カスタムマーカーを受け取るべきかを示すプロンプトが表示されます。 </li></ol> 2。分析計測器上のユーザー定義マーカーのサンプルスキャン<ol><li> CSSを使用して患者血液サンプルから標準のCTC列挙の3.2節で説明したように、分析装置の電源を入れ、ランプを初期化し、品質管理とシステム検証を実行</strong&gt;プロトコル。 </li><li>分析装置にサンプルをロードし、[セットアップ ] タブを選択します。 FITCチャンネルを初期化するには、 試験プロトコル]セクションの下にキットのIDとしてCellSearch CTCを選択します。このメニューから、CTCの研究を選択し、[編集]ボタンをクリックし、必要に応じて露光時間を設定します。これは、CTCの識別に利用される他の蛍光チャンネルにブリードスルーを増やすことができますように、CSSのCTCキットを使用する際に1.0秒の露光時間を超えないことをお勧めします。 </li></ol> 3。前臨床マウスモデルで使用するための標準CSSProtocolの適応 ** Veridexマウス/ラットCellCaptureキットからの適用（もはや商業的に入手可能） 1。マウス採血および保管<ol><li>採血前、0.5M EDTAを30μlのは、ハブ中のEDTA、少量を残して、前後に22 G針を通して〜を実行します。 </li><li>以前同所、尾静脈、または心臓内経路を介してヒト腫瘍細胞を注射したマウスからマウスの血液を50μlの最小値を収集します。 （シリアルCTC分析用）伏在静脈から、または（端末のCTC分析用）心臓穿刺により血液を収集します。針を外し、1ミリリットルのEDTAマイクロテイ採血管に血液を分注する。血液の凝固を防ぐために、反転やそっとフリックチューブで混ぜる。血液はCytoChexセルラ防腐剤、等量の添加直後に処理されるか、最大48時間室温で保存することができる。 </li></ol> 2。 CTCの濃縮<ol><li>冷蔵庫からCSSの試薬を除去し、それらを使用する前に室温に加温することができます。 </li><li> 12ミリメートル×75ミリメートル、フローサイトメトリーチューブに全血50μlのと同等のものを転送します。チューブの両側に残っているいずれかの血液を下洗い、各サンプルに希釈緩衝液500μlを追加します。必要に応じて、短い遠心スピン残りの血液を採取するために使用することができる。 </li><li>優しく抗EpCAM磁性流体を渦を直接試料にピペットの先端を配置することによって、各サンプルに25μlを加える。穏やかに混合するキャプチャ強化試薬と渦の25を添加する。 15分間、室温でサンプルをインキュベートする。 </li><li>磁石へのサンプルチューブをセットし、10分間インキュベートする。サンプルチューブを磁石に残っている間に、慎重に次の磁石にチューブの壁に触れることなく残留液を吸引し、廃棄するようにガラスピペットを使用しています。 </li></ol> 3。 CTC染色<ol><li>核酸染料、染色試薬、抗マウスCD45-APC、抗ヒトHLA-アレクサフルーア488、および透過100μlを5.0μLの1.5μlを50μlを50μlの磁石を再懸濁からサンプルチューブを取り外す試薬。複数の試料については、これらの試薬は、予め混合してもよいし、混合物の206.5μlを各チューブに添加してもよい。穏やかに混合する渦暗所で室温で20分間インキュベートする。 </li><li>希釈緩衝液500μlを加え、ボルテックス優しく、磁石への場所のサンプルチューブを、そして10分間インキュベートする。サンプルチューブを磁石に残っている間に、慎重に次の磁石にチューブの壁に触れることなく残留液を吸引し、廃棄するようにガラスピペットを使用しています。磁石からサンプルチューブを取り外し、希釈緩衝液350μlに懸濁します。渦を静かに混合する。 </li></ol> 4。磁気デバイスのロード<ol><li>ゲルローディングチップを使用して、慎重に磁気デバイス内のカートリッジにサンプルチューブからボリューム全体を転送します。カートリッジの下部に起動し、サンプルが分配されるように、ゆっくりと先端を引き出す。 </li><li>サンプル全体が転送されると、緩く磁気デバイスカートリッジにキャップをし、切開の説明に従って、カートリッジの端に貼り付けられている任意の泡を解放するために手や実験台を用いた磁気デバイスをタップしますN CSSを使用して患者血液サンプルから標準のCTC列挙の3.1。 </li><li>ベベルとカートリッジの縁との間に、それらを捕捉することによって、滅菌22 G針を使用して、任意の気泡をポップします。すべての気泡が除去されていると、しっかりと、カートリッジにキャップを平らな磁気デバイスを置き、少なくとも10分間、暗所でインキュベートする。サンプルは準備の24時間以内にスキャンする必要があります。 </li></ol> 5。分析計測器で手動で分離されたサンプルのスキャン<ol><li> 、分析装置の電源を入れ、ランプを初期化して、CSSのプロトコルを使用して患者血液サンプルから標準のCTC列挙の3.2節で説明したように、品質管理とシステムの検証を行う。 </li><li>分析装置にサンプルをロードし、[セットアップ ] タブを選択します。 フォーマットのサンプルボタンをクリックすることにより、磁気デバイスのデータボタン上の既存のデータをクリアします。 FITCチャンネルAを使用可能にCSSを使用してユーザー定義のマーカーについて、CTCの特徴付けのセクション2.2で説明したようにND 1.0秒の露光時間を設定します。 </li><li> 患者の試験タブをクリックして入力するサンプル情報を編集]を選択します。 試験プロトコルとしてキットIDとCellSearch CTCとCTCの研究を選択します。入力アスタリスクとして示されているように、残りの必要な情報。サンプル情報を保存し、[開始]をクリックします。 </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

著者（ALA）は、その親会社ジョンソン·エンド·ジョンソンはまた、この記事で使用した試薬や器具を生産ヤンセン診断LLCを所有ヤンセン腫瘍学、提供された資金を受け取った。

2004年には、CSSが導入されて以来、多くの新しいCTC技術の開発にもかかわらず、この技術は、現在も市場で唯一の臨床的に承認の技術であるため、それは、CTCの検出および計数のための現在のゴールドスタンダードと考えられている。この原稿は、CSSが厳格な品質管理基準を有しているが、それが解釈バイアスの対象とし、患者サンプル中のCTC識別が添加サンプルの身分と大きく異なってい?...

2013年には580350人々が癌で死亡すると推定されており、この病気のこと1660290新しい例は、一人で1米国で診 ​​断されます。これらの死亡の大半は転移性疾患2の開発に続いて起こる。転移および転移カスケードの限られた理解の治療に有効な治療法の現在の不足は、病気のこの段階は非常に致命的なことができます。血流内の腫瘍細胞（CTCの）の循環の存在は、転移性疾患3と相関することが実証されている。これらの細胞は非常にまれであり、その検出は、転移性乳癌4、前立腺5で全生存期間を示すものであり、大腸癌6。少ないまたはSAMにおいて検出のCTCを有する患者と比較した場合、これらの患者では、血液7.5mlの中≥5（乳癌および前立腺）の存在下または≥3（大腸）のCTCは、予後不良の指標であるEの血液量。また、治療的介入の間または後のCTC数の変化は、しばしば、より早く現在利用技術7-10よりも、治療応答の予測因子として有用であることが実証されている。 それは、転移癌患者において、CTCのは10 5〜10 7血単核細胞当たり約1 CTCの頻度で発生し、限局性疾患を有する患者において、この周波数は（1〜10 8で〜）であっても低くてもよい、と推定されている。これらの細胞のまれな性質は、それが困難で正確かつ確実11のCTC を検出し、分析することができる。 （以前は12〜14日）のいくつかの方法は、血液成分を囲むと区別する特性を利用することにより、これらの細胞を濃縮し、検出するために利用されてきた。一般的には、CTCの列挙は、濃縮工程と検出工程の両方を必要とする2段階のプロセスである。伝統的に、濃縮のステップは、物理の違いに依存しているCTCの（細胞の大きさ、密度、変形能）またはタンパク質マーカー発現に対する（ すなわち、上皮細胞接着分子[EpCAMの】サイトケラチン[CK]）のiCalの特性。濃縮後、CTCの検出は、核酸に基づくアッセイおよび/またはフローサイトメトリーアプローチである最も一般的なものは、異なる多くの方法で行うことができる。これらの戦略はそれぞれ異なる利点と欠点を持つが、それらすべてが標準化を欠いている、ユニークである。臨床現場への進入のための必要性。 CellSearchシステム（CSS）は、したがって、蛍光顕微鏡および抗体ベースの技術4-6を用いて、ヒト血液中の希少なCTCの検出および計数のための標準化された方法を提供することを目的に開発されました。このプラットフォームは現在、CTCの列挙型のゴールドスタンダードとみなされ、診療所15で使用するために米国食品医薬品局（FDA）によって承認された唯一の技術です。 CSSは、2コンポーネントのプラットフォームconsistinですgの、ヒト血液試料の調製を自動化（1）CellTracksオートプレップシステム（以下、製造装置ともいう）と、これらをスキャンし、（2）CellTracksアナライザーII（以下、分析装置と称す）調製後のサンプル。準備器具白血球を汚染するのCTCを区別することは、抗体媒介性、磁性流体ベースの磁気分離手法及び示差的な蛍光染色を使用する。最初に、システムは、鉄ナノ粒子にコンジュゲート抗EpCAM抗体を使用したCTCを標識する。次いで、試料を磁場中でインキュベートされ、全ての未標識細胞が吸引される。選択された腫瘍細胞は、蛍光標識抗体と核染色試薬からなる差動蛍光染色に再懸濁し、インキュベートする。最後に、試料を、磁気カートリッジに移し（以下、磁気装置ともいう）と呼ばれるMagNest、およびscさ分析機器を用いてanned。 分析装置は、10X対物レンズを用いて、異なる蛍光フィルターを用いて調製されたサンプルは、適切な蛍光体粒子に最適化された各々をスキャンするために使用される。 CTCのは、抗EpCAM、抗パン-CK-フィコエリスリン（PE）が結合する細胞（CK8、18、および19）、および核染色4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）として識別される。逆に、混入白血球を、抗CD45-アロフィコシアニン（APC）およびDAPIが結合する細胞として同定される。走査に続いて、コンピュータで定義された潜在的な腫瘍細胞がユーザに提示される。これらの画像から、ユーザは、CTCのあるイベントを決定するために、上記の定義されたパラメータと差動染色を用いて定性分析を採用する必要があります。 CTCの計数のために標準化された方法を提供することに加えて、CSSは、目的のタンパク質マーカーに基づいて、CTCの分子特徴づけを可能にする。この呼び掛けCCTCの同定16には必要ないフルオレセインイソチオシアネート（FITC）蛍光チャンネルを使用して、単一細胞レベルで実行することができる。このプラットフォームは、分子特性解析のための能力を提供するが、プロトコル開発および最適化の詳細な処理は、明確に定義されていない。 3種の市販のマーカーは、上皮成長因子受容体（EGFR）、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）、およびインスリン様成長因子1受容体（IGF-1R）を含む、CSSでの使用のために製造業者によって開発されている。 HER2分析は、CSSと組み合わせて、臨床意思決定を通知するために、潜在的に既存の治療ガイドラインを変更するCTCの特徴づけの可能性を例示するためにいくつかのグループによって利用されてきた。例えば、Fehm ら は、HER2-17原発腫瘍を有する乳癌患者の約3分の1は、HER2 +のCTCを有していたことを実証した。また、Liu ら。18は最近、HER +転移性乳癌患者の最大50％がHER2陽性のCTCを持っていなかったことを報告した。ハーセプチン、大幅に腫瘍がHER2の十分なレベルを発現、HER2陽性原発腫瘍19〜21の患者さんのために一般的に利用され、治療された患者に利益をもたらすことが実証モノクローナル抗体を妨害HER2受容体。しかしながら、これらの研究は、ハーセプチンは、サブ最適に利用し、CTCの特徴づけは、治療応答の予測を助けることができることであることができることを示唆している。最終的に、CTCの特徴づけは、パーソナライズされたケアを改善する可能性を有していてもよい。 それは主にベッドサイド·ツー·ベンチトップアプローチを利用しているという点で、CTCの研究がユニークです。この方法は、多くの場合、患者のケアに影響を与えるには何年もかかることができ、ベンチトップ·ツー·ベッドサイドの研究とは異なり、臨床現場へのCTCクイック入力を可能にした。しかし、医師は患者の治療の意思決定MAKで、CTCの分析の結果を使用して躊躇しているそれらの基礎となる生物学の理解の不足のためにING。したがって、転移および相補CTC分析技術の適切な前臨床マウスモデルが、これらの未解決の疑問を調査するために利用されなければならない。一般的には、転移カスケードのすべてのステップの研究を可能にする転移カスケードを研究するために使用される前臨床モデルの2つのタイプ、（1）自然転移モデルは、存在のみを可能にする（2）実験的転移モデルこのような血管外漏出と二次腫瘍形成22として、転移プロセスの後の段階の研究。自然転移モデル（前立腺癌の研究のための前立腺に前立腺癌細胞の例えば、注射）の適切な位置に同所性腫瘍細胞の注射を伴う。次いで、細胞を、原発腫瘍を形成し、自発的に、骨、肺、およびリンパ節などの二次部位に転移する時間が与えられる。でこれに対し、実験的転移モデルは、（特定の場所に細胞を標的とする尾静脈や心臓内注射を介してなどして ）血流への腫瘍細胞の直接注入を含んでいるため、二次的な器官22に血管内および普及の初期段階をスキップします。これまでのin vivoモデル系においてCTC解析の大部分は、フローサイトメトリーベース23又はヒト適合CTCベースの技術（ 例えば AdnaTest）24のいずれかを用いて行われた。有用ではあるが、これらの技術はいずれも、適切にゴールドスタンダードのCSSを使用して、CTCの列挙を反映していない。結果は、匹敵するであろうように、臨床承認、標準化された性質、及びCSSの広範な使用に基づいて、 インビボためのCTC捕捉および検出技術の開発が同等の試料調製、処理、および識別基準を利用してモデリングが有利で ​​あろう患者試料から得られた。しかしながら、ボリュームREQに準備器具のuirementsは、この自動化されたプラットフォームを使用して少量の血液を処理することは不可能である。イリアーヌらのほかに、これまでの研究25は、マウス上皮細胞の試料の汚染（標準、CTCの定義を満たす[のEpCAM + CK + DAPI + CD45が- ]）ことを実証しています。、マウス扁平上皮細胞の誤分類につながる可能性CTCの。これらの問題のマニュアルを単離操作と組み合わせたCSSのCTCキット試薬​​の利用が開発されたことができようになった技術に対処するために。アッセイのFITC標識ヒト白血球抗原（HLA）抗体の添加は、ヒト腫瘍細胞がマウス扁平上皮細胞と区別することを可能にする。 この原稿がdiscrepan含め遭遇する可能性がある患者の血液サンプルと共通の落とし穴を、処理するための商業的に開発された標準、および最適化されたCSSのプロトコルを記述CTCの誤分類エラーが発生する可能性のT項目。また、収集したCTCのユーザ定義のタンパク質の特性を調べるためのCSSアッセイのカスタマイズおよび転移の前臨床マウスモデルにおいて少量の血液からのCTCの濃縮および検出を可能に匹敵するように適合CSS技術が記載されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

癌関連死の大半は、転移性疾患の発症に続いて起こる。この非常に致命的な病気のステージは循環腫瘍細胞（CTCの）の存在と関連している。これらの稀な細胞は、転移性乳癌、前立腺癌、および結腸直腸癌における臨床的に重要であることが実証されている。臨床のCTC検出および計数の現在のゴールドスタンダードは、FDA-クリアCellSearchシステム（CSS）である。この原稿は、標準を使用して、このプラットフォームが利用する標準プロトコルだけでなく、タンパク質の患者CTCの特性評価およびCTCは、血液の非常に低いボリュームをキャプチャするための比較可能なプロトコルのためのユーザー定義のマーカーの最適化の詳細な処理を記述する二つの追加適応のプロトコルの概要を説明転移のin vivoでの前臨床マウスモデルで研究するためのCSSの試薬 ​​。また、健康なドナーの血液との間のCTCの品質の違いは、患者の血液SAMPに対する組織培養由来の細胞をスパイクレスが強調表示されます。最後に、CTCの誤分類エラーにつながることができるいくつかの一般的な矛盾の項目が概説されている。まとめると、これらのプロトコルは、転移およびCTCのに関する前臨床および臨床研究に興味を持って、このプラットフォームのユーザーにとって有益なリソースを提供します。

標準CTC列挙アッセイ CSSの感度および特異性は、文献に記載されている。しかし、同等のCTCの回収を検証するために、スパイク（1,000たLNCaPヒト前立腺癌細胞）および健常ドナー由来のスパイクしていないヒトの血液サンプルは、標準的なCSSCTCプロトコルを使用して、CSSで処理した。予想されるように、スパイクしていないサンプルは、0.00±0.00％CTCの自由だった、とCTCの回収...

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Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

循環腫瘍細胞（CTCの）は、いくつかの転移性癌において予後である。この原稿は、ゴールドスタンダードCellSearchシステム（CSS）CTC列挙プラットフォームについて説明し、一般的な誤分類のエラーを強調しています。さらに、2つの適合プロトコルはこの技術を用いた転移の前臨床マウスモデルでのCTCおよびCTC列挙のユーザ定義のマーカーの特徴付けのために記載されている。

臨床および前臨床研究用途のための半自動循環腫瘍細胞（CTC）アッセイの適応

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

adaptation-semiautomated-circulating-tumor-cell-ctc-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

15.8K ビュー.  London Health Sciences Centre. 循環腫瘍細胞（CTCの）は、いくつかの転移性癌において予後である。この原稿は、ゴールドスタンダードCellSearchシステム（CSS）CTC列挙プラットフォームについて説明し、一般的な誤分類のエラーを強調しています。さらに、2つの適合プロトコルはこの技術を用いた転移の前臨床マウスモデルでのCTCおよびCTC列挙のユーザ定義のマーカーの特徴付けのため...

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

ソート幹細胞アッセイおよびフローの原発性脳腫瘍組織の処理

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

医学

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

細胞追跡のためのin vivoでの19 F MRI における

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

小説<em&gt; in vivoで</em&gt;遺伝子導入技術と<em&gt; in vitroで</em筋骨格障害における骨損失の検討のための&gt;細胞ベースのアッセイ

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

エキソビボ処理前臨床のための原発腫瘍および/ ​​または関連した転移の応答と治療薬の臨床開発

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

マウス癌モデルからの循環腫瘍細胞の単離と伝播

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Proton Therapy Delivery and Its Clinical Application in Select Solid Tumor Malignancies

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of radiation, the in vivo properties of photon and proton beams differ greatly and maybe exploited to optimize clinical outcomes. In particular, proton particles lose energy in a predictable manner as they pass through the body. This property is used clinically to control the depth at which the proton beam is terminated, and to limit radiation dose beyond the target region. This strategy can allow for substantial reductions in radiation dose to normal tissues located just beyond a tumor target. However, the degradation of proton energy in the body remains highly sensitive to tissue density. As a consequence, any changes in tissue density during the course of treatment may significantly alter proton dosimetry. Such changes may occur through alterations in body weight, respiration, or bowel filling/gas, and may result in unfavorable dose deposition. In this manuscript, we provide a detailed method for the delivery of proton therapy using both passive scatter and pencil beam scanning techniques for prostate cancer. Although the described procedure directly pertains to prostate cancer patients, the method may be adapted and applied for the treatment of virtually all solid tumors. Our aim is to equip readers with a better understanding of proton therapy delivery and outcomes in order to facilitate the appropriate integration of this modality during cancer therapy.

The fundamentals of radiation planning and delivery for proton therapy using prostate cancer as a model are presented. The application of these principles to other selected disease sites highlights how proton radiotherapy may enhance clinical outcomes for cancer patients.

プロトン療法配信と選択固体腫瘍悪性腫瘍の臨床応用

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

腸血液関門と微生物叢製品の肝代謝を評価するためのIn Vivo法

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

増殖糖尿病網膜症における線合併症の体外培養モデル

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...