このプロトコルは、拡張系に基づく他のフィーダー細胞と比較して、機能的で非網羅的なメモリー様NK細胞のエクスビボでの増殖を有意に改善することができる。これは、NK細胞増殖前のNK細胞単離ステップをスキップするフィーダー細胞を使用する他のプロトコルと比較して、より簡単な方法です。このプロトコールは、免疫療法のために十分な数のNK細胞およびCAR-NKを提供することができる。
この手法は再現性が高いです。ただし、新鮮で新しい出発物質を使用し、増殖の最初の数日間はNK細胞を乱さないように注意することが重要です。まず、無菌手術器具を使用して生存組織領域を特定して切片化し、リンパ球を取得します。
次に、切片化した組織をカルシウムまたはマグネシウムを含まない30ミリリットルのHBSSに入れ、分離の準備ができるまで組織を氷上に置いておきます。バイオセーフティキャビネット内で作業し、滅菌かみそりの刃と鉗子で組織を0.5センチメートル未満の立方体に細かく刻みます。細かく刻んだ組織片を4グラム以下の組織解離管に入れ、10ミリリットルのコラゲナーゼIVを組織片に加えます。
組織を完全にミンチするには、組織解離剤チューブを摂氏37度の組織解離剤に処理します。組織解離剤からチューブを取り外した後、5ミリリットルのシリンジのバックエンドを使用して、40ミクロンのナイロンセルストレーナーを通してミンチ組織を粉砕します。大きな未消化の断片を捨てます。
採取した溶離液を室温で400Gで5分間スピンダウンし、上清を吸引してから、細胞ペレットを30%ポリビニルピロリドンコーティングシリカに再懸濁して脂肪細胞を除去します。説明に従って細胞をスピンダウンしてから、細胞ペレットを9ミリリットルのR-10培地に再懸濁します。赤血球および多形核細胞からリンパ球を分離するには、細胞懸濁液を4ミリリットルのFicollまたはリンパ球分離培地に注意深く重ねます。
加速とブレーキをオフにして、室温で400Gで23分間遠心分離して層を分離します。次に、上層から中層を注意深くデカントし、組織浸潤リンパ球を含む間期を採取します。細胞を10ミリリットルの培地ですすぎ、分析または一次ナチュラルキラー(NK)細胞増殖プロトコルに進みます。
末梢血単核球(PBMC)と100個のガンマ線照射された221-mIL-21細胞を、10ミリリットルのR-10培地で400Gで5分間遠心分離することにより別々に洗浄します。遠心分離後、フローサイトメトリー用に1 x 10を6番目のPBMCに保存し、5 x 10を6番目のPBMCに10 x 10から6番目の100ガンマ線照射221-mIL-21細胞を特別な6ウェルプレートで混合します。ヒトインターロイキン-2とヒトインターロイキン-15を添加した30ミリリットルのR-10培地を同じ6ウェルプレートに加え、37°Cで5%二酸化炭素でプレートをインキュベートし、3〜4日ごとに培地を交換します。
インキュベーション中、全末梢血ナチュラルキラー(PBNK)の細胞生存率を記録し、3〜4日ごとにフローサイトメトリーを実行してNK細胞増殖率を算出する。処理した100ミリメートルプレートあたり11ミリリットルのD-10培地中の6番目の293T細胞に1.8 x 10を加え、293T細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベートします。1.70ミリリットルのチューブで、470マイクロリットルの還元血清培地を30マイクロリットルのトランスフェクション試薬と混合します。
別の1.70ミリリットルのチューブに、SFGベクター中の2.5マイクログラムのpRDFプラスミド、3.75マイクログラムのPegpam3プラスミド、および2.5マイクログラムのCARコンストラクトを還元血清培地に加え、最終容量500マイクロリットルにします。チューブの内容物を、前に準備した1.70ミリリットルのチューブと滴下して混合します。室温で15分間インキュベートした後、1ミリリットルの混合物をチューブから293Tセルプレートに滴下して加え、プレートを5%二酸化炭素を含む摂氏37度に48〜72時間置きます。
レトロネクチンタンパク質をPBSでミリリットル当たり50〜100マイクログラムの最終濃度に希釈する。500マイクロリットルの希釈レトロネクチンを未処理の24ウェルプレートの各ウェルに加える。次に、パラフィルムを使用してプレートを密封し、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、レトロネクチンプレートを摂氏4度で30分間2、103Gで遠心分離し、上清を廃棄する。24ウェルプレートの各ウェルを1ミリリットルのR-10培地でブロッキングした後、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で1時間インキュベートします。0.45ミクロンのフィルターを使用して以前にトランスフェクトした293T細胞をろ過し、レトロウイルス上清を収集します。
濾過したレトロウイルス上清2ミリリットルを24ウェルレトロネクチンプレートの各ウェルに分注する。24ウェルレトロネクチンプレートを2, 103Gで2時間遠心分離し、摂氏32度で予熱した遠心分離機に入れます。プレートが遠心分離されている間に、0日目から増殖したPBNK細胞を収集し、トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。
増殖したPBNK細胞を、インターロイキン-2およびインターロイキン-15を添加したR-10培地で、ミリリットル当たり2.5 x 10〜5〜5 x 10〜5番目の細胞の濃度に希釈する。24穴レトロネクチンプレートの遠心分離後、各ウェルからレトロウイルス上清を部分的に吸引する。次に、2ミリリットルの希釈膨張PBNK細胞を各ウェルに加えます。
プレートを摂氏32度で600Gで10分間遠心分離してから、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で48〜72時間インキュベートします。細胞を24ウェルプレートから50ミリリットルの遠沈管に移し、チューブを400Gで5分間遠心分離します。ペレットを1ミリリットルのR-10培地で再懸濁した後、再懸濁した細胞を、インターロイキン-2およびインターロイキン-15を添加した30ミリリットルのR-10培地を含む特別な6ウェルプレートに移します。
特殊な6ウェルプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%でさわやかな培地でインキュベートし、3〜4日ごとにNK細胞の増殖率を計算します。221-mIL-21によって拡大されたPBNK細胞は、ほぼ5 x 10倍から4倍に拡大することが示された。NK細胞の純度は、21日間の増殖を通して約85%に維持された。
増殖に先立ち、221-mIL-21増殖系の頑健性を抗CD56および抗CD3のPBMCを染色して調べたところ、NK細胞では7.09%の細胞純度とT細胞の割合が高いことが示されました。PBMCおよび221-mIL-21共培養の4日目に、CAR-NK形質導入前にNK純度をチェックした。抗CD56、抗CD3、抗ヒトIgGで染色したCAR-NK細胞は、7日目に高いNK細胞集団を示し、約70%の高いCAR形質導入効率が観察されました。
18日目に、様々なサブセットにおけるCAR発現をフローサイトメトリーで確認した。NK細胞増殖に続いて、細胞はインビトロ機能アッセイまたはインビボ実験に使用できます。研究者は、このプロトコルを使用して、機能的NK欠損症の患者や犬などの他の種に対してNKおよびCAR-NKを拡大できます。
