癌治療のための細胞傷害性サイトカイン誘発キラーT細胞の分離と拡張

PBMC由来サイトカイン誘導キラーT細胞の増殖と癌に対する細胞毒性の評価のために、高度に修飾された臨床的に適用可能な方法を最適化しました。この技術の利点は、科学的研究と臨床評価の両方でサイトカイン誘発キラー細胞の効力を定量化するために、技術者および臨床医のための標準的な操作手順を提供することです。テキストプロトコルに記載されているようにCIK細胞の調製からこの手順を開始し、その後、滅菌PBSの10ミリリットルでCIK細胞を洗浄します。

遠心分離機はGの300倍と摂氏18〜20度で10分間。上清を吸引し、PBSの5ミリリットルで細胞を再懸濁します。トリパンブルー排除アッセイを使用して、細胞数とテストセルの生存率をカウントします。

アリコートCIK細胞を、PBSの1ミリリットル当たり約5〜100万個の密度で、6つの滅菌1.5ミリリットルチューブに入る。テキスト プロトコルで詳細なようにセルにラベルを付け、処理します。CIK細胞を抗体と穏やかに混合し、少なくとも3回は1ミリリットルの滅菌ピペットで上下にピペット化します。

暗い温度で15分間細胞をインキュベートします。チューブをGの300倍、摂氏18~20度で10分間遠心します。遠心分離後、上清を吸引し、PBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁し、1ミリリットルの無菌ピペットで少なくとも3回は細胞を上下に軽くピペットします。

セルサスペンションを、キャップをそっとピペットでセルストレーナーキャップ付きの無菌5ミリリットルポリスチレンラウンドボトムチューブに移し、カルーセルにチューブを順番に置きます。フローサイトメトリー解析ソフトウェアを開いて実験用フォルダを作成し、新しい標本ボタンをクリックして、実験に標本とチューブを追加します。テキスト プロトコルに記載されているチューブに名前を付けます。

CIK セルの集団の散布ゲート システムを作成するには、まずチューブ 1 を選択し、ドット プロット ボタンをクリックして FSCA SSCA プロットを作成します。5000 を超える FSCA しきい値を持つセル全体に長方形ゲートを描画し、セルの破片を除外します。新しいドット プロットの FSCA FSCH パラメータを選択し、すべての単一セルの周囲にポリゴン ゲートを描画します。

新しいヒストグラムプロットの場合、FITC結合CD3とAPC共役CD56パラメータのカウントを選択します。新しいドットプロットに対して FITC 結合 CD3 と APC 共役 CD56 パラメータを選択し、4 つの区画ゲートを描画して 4 つのサブ人口を定義します。各標本に20,000個の単一細胞からのデータを記録する。

最初に空のコントロール サンプルを分析するには、負荷サンプル ボタンをクリックします。CD56 および CD3 チャネル・パラメーターを使用して、CIK セルの全体を識別します。個々の標本の統計値を含むファイルを開いて、CIK細胞集団を解析し、分析ファイルに再印刷します。

細胞傷害性アッセイを行うために、コカルチャーCIKとヒト慢性骨髄性白血病K562細胞を、1ミリリットル当たり500万個の密度で6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルずつ加え、CIK細胞の有無にかかわらず1ミリリットルの基底培地をテキストプロトコルに記載されている6ウェルプレートに加える。少なくとも3回は上下にピペットを軽く入れ、細胞懸濁液を混ぜます。プレートをインキュベーターに24時間置きます。

さて、CIKおよび卵巣OC-3細胞を、テキストプロトコルに記載されている6ウェルプレートにCIK細胞の有無にかかわらず1ミリリットルの基底培地を加えることによって培養する。少なくとも3回は上下にピペットを軽く入れ、細胞懸濁液を混ぜます。プレートをインキュベーターに24時間入れます。

インキュベーション後、CIK K562細胞懸濁液を15ミリリットルの滅菌チューブに直接収穫します。CIK OC-3群から懸濁細胞と付着細胞の両方を収穫するために、まず細胞懸濁液を15ミリリットルの無菌チューブに移す。1ミリリットルの滅菌PBSで井戸を洗い、PBSを採取し、チューブに加え、5ミリリットルの細胞解離酵素溶液を加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。

同じチューブから対応するウェルに溶液の1ミリリットルを加え、1ミリリットルの滅菌ピペットで少なくとも3回上下にピペットを作って細胞を穏やかに混合します。同じチューブ内のすべてのセルを収集します。遠心分離機はGの300倍で10分間行う。

上清を吸引し、滅菌PBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁する。細胞を10分間Gの300倍にペレットし、その後上清を吸引し、100マイクロリットルの無菌PBSで細胞を再懸濁した。細胞懸濁液に7-AAD染料5マイクロリットルを加えます。

少なくとも3回は1ミリリットルの滅菌ピペットで上下にピペットを作って細胞を穏やかに混合します。10分間インキュベートし、分析前に暗闇の中に放置します。細胞分解能アッセイを行うために、細胞懸濁液を混合し、フローサイトメトリーの準備を繰り返す。

新しい標本ボタンをクリックして、試験体とチューブを実験に追加します。テキスト プロトコルに記載されているチューブに名前を付けます。細胞分解アッセイ用の散乱ゲートシステムを作成するには、まずチューブ1を選択し、ドットプロットボタンをクリックしてFSCA SSCAプロットを作成します。

FSCA しきい値が 50,000 を超えるイベントのすべてに長方形ゲートを描画し、セルの破片を除外します。新しいドット プロットの SSCA CFSE パラメータを選択し、新しいドット プロットの 7-AAD CFSE パラメータを選択し、4 つの区画ゲートを描画して 4 つのサブアマッサンを定義します。最初に空のコントロール サンプルを分析するには、負荷サンプル ボタンをクリックします。

SSCA と FSCA の電圧を調整します。CFSE および 7-AAD チャネル・パラメーターを使用して、死細胞の母集団を識別します。各標本に20,000以上のCFSE陽性細胞からのデータを記録します。

個々の標本の統計値を含むファイルを開いて、非生存細胞集団を分析し、データを分析ファイルにエクスポートします。健常ドナーからのCD-3陽性CD56陽性T細胞のサブ集団を分析するための格行戦略の代表的な結果を、3人の個体からのCIK比率の統計分析と共に示した。CD-3陽性CD56陽性細胞比率は14日後に有意に増加した。

これは、14日目に収穫されたCIK細胞に対して27.4%に増加した元のPBMCの65%を通じて明らかである。この培養系では、CIK細胞はPBMCsの元の数に比べて約500倍の変化をもたらした。K562細胞は非蛍光色素CFSEで染色され、生細胞内の細胞内エステラーゼによって切断され、高蛍光色素となった。

CIK および CFSE 陽性セルのサイズと粒度を示します。CFSE染色K562細胞を、0対1、5対1、および10対1の比率でCIK細胞と共処理した。これらの細胞は、死細胞排除のための生存プローブとして7-AAD色素で染色した。

CFSE陽性K562細胞の7-AAD陽性細胞を全て評価した。CFSE染色OC-3細胞を10対1の比でCIK細胞と共処理した。OC-3細胞に対するCIKの明らかな細胞毒性は、24時間のインキュベーションの後にここで実証される。

CIK T細胞は、がん細胞に対して著しい細胞傷害作用を及ぼし、癌治療における手術、放射線、化学療法の副作用を軽減することが報告されている。免疫療法は、多くの癌に対する有望な治療法です。CIKは、さらなる自己注入のためのGMPグレードの状態で患者由来のPMBCのインキュベーションによって、効率的にインビトロで拡張することができる。

このプロトコルに従って、我々はさらなる臨床癌治療のためにGTPまたはGMPグレードの施設で免疫細胞療法を実行することができた。