このプロトコルは、マウス肺弁の構造機能相関に関する質問に答えるように設計されているため、重要であり、これは固有の不均一性のために一般的にトリッキーです。制御された固定および相関的なイメージ投射は、複数の長さのスケールで構造を捕獲するために使用された。局所的な高解像度画像は、肺弁の正確な解剖学的位置にマッピングすることができます。
この手順を実証するのが、全国小児病院再生医療センターのマイクロサージャリー所長の太平氏です。まず、細かいはさみ、マイクロフォースプ、微小血管クランプ、クランプ適用鉗子、マイクロニードルホルダー、スプリングハサミ、リトラクターなど、マウス解剖に必要なツールをオートクレーブします。成人のC57BL/6マウスを安楽死させた後、トレイの後ろ方向のリカンベント位置に置き、テープで手足を固定し、回折術を行います。
余分な脂肪組織と筋膜を取り除くことによって心臓を露出させ、次に右心房を取り除き、室温生理食糸溶液で左心室を浸透させる。上の大静脈、下の大静脈、肺動脈、大動脈を切断して心臓全体を取り除き、加圧の導管となる心房接合部の上に約2ミリメートル切断する。左右の心室を取り外して室を大気圧にさらし、心室を取り除くことで肺幹構造が影響を受けないようにします。
肺動脈を伴う吻合加圧チューブは、リーフレットと肺幹の大きな動きに対応するために、座管接合部と管の端部との間に約1ミリメートルの距離を残す。貯水池を類似の生理学的圧力に引き上げ、生理食塩水で満たします。フロースルーシステムをテストして、閉塞や気泡がないことを確認します。
吸着肺動脈弁にストップコックを取り付け、流出管を切り替えてチューブを通る十分な流れを確保します。流れが十分になったら、流出を吻合肺動脈弁に切り替え、トランクの張り出しによって識別される肺幹の加圧を確実にする。肺幹の加圧を確認した後、生理液の貯留容量の25%がパージされるまで、一次固定液を徐々に組み込む。
乾燥を防ぐために、組織サンプルの上に固定剤浸しガーゼを置きます。固定剤を3時間浸透し、貯蔵所を補充して一定の圧力を維持する。灌流後、心臓弁を摂氏4度で固定液に保存し、最大1週間使用します。
染色の場合は、固定心臓弁サンプルを冷たい0.15モルカコチル酸塩緩衝液で5分間3回洗浄し、1.5カリウムフェロシア化、0.15モルカコチル酸、塩化ミタールカルシウム2個、氷上2%オスミウム四酸化2%の溶液に心臓弁を完全に水没させます。サンプルを軽く撹拌して5分間チューブに入れて、室温二重蒸留水で洗浄します。さらに3回の洗剤を行った後、試料を濾過チオカルボヒドラジド溶液を室温で入れる。
20分後、先に示したように、サンプルを水で3回洗います。次に、試料を室温で2%オスミウム四酸化に入れる。30分後、それぞれ5分間水で3回洗浄し、摂氏4度で一晩1%酢酸1%の酢酸でサンプルをインキュベートします。
一方、硝酸鉛の溶液を調製する。翌日、先に示したように洗浄工程を3回行い、次いで心臓弁組織を摂氏60度で30分間摂氏60度で培養した。サンプルをさらに3回洗浄し、次に、それぞれ5分間、氷上で20、50、70、および90%エタノールを調製し、その後100%エタノールで2回処理して、心臓弁組織に連続脱水処理を行います。
脱水後、氷冷アセトンに組織を移動し、10分間室温で新鮮なアセトンに入れます。埋め込み用には、メーカーの仕様に従って樹脂混合物を作ります。25~75、50~50、75~25の樹脂を2時間用いた後の処理に組織を入れる。
最後に、一晩100%樹脂に組織を入れます。翌日、ティッシュを100%樹脂に入れる。2時間後、組織を埋め込みカプセルに移し、新鮮な100%樹脂を加え、60度の摂氏オーブンに48時間置いて治します。
静水圧の適用前後の切除された吻合肺動脈をここに示す。肺幹は、肺弁のリーフレットが閉じた構成であることを示す放射状に膨張する。微小断層撮影は肺弁の確認を確認した。
リーフレットは閉じ、環状は円形であったが、固定または動脈崩壊のいずれかによって肺弁圧が不十分な程度が観察された。仮想断面をレンダリングするマイクロCTボリュームは、スライス方向と位置を確認するために光学画像と相関していた。高解像度SBF SEM画像は、標本ブロックが所望の位置と向きにあったときにリーフレット内のローカル領域で撮影された。
マイクロ CT ボリューム レンダリング仮想スライス、低解像度、および高解像度 SBF SEM イメージ間の相関画像を次に示します。肺弁のセグメント化された領域の3D表現では、内皮細胞、弁膜間質細胞、および細胞外繊維のような細胞外成分が同定できる。このプロトコルを試す際には、加圧を行うことは重要であり、できるだけ高い収率を確保することに注意してください。
