このプロトコルは、エンハンサー配列が発現を駆動できるかどうかだけでなく、身体の特定の部分で発現を駆動できる場所を視覚化できるため、重要です。それは速いです。注入は完了するのに10分もかからず、レポーター遺伝子が発現しているかどうか、どこで発現しているかは、サンプル収集からわずか数日以内に確認できます。
クローン作成を開始するには、レポーター構造を選択または設計します。ここで使用される構築物は、hsp68最小プロモーターの制御下で発現されるEGFPレポーター遺伝子の3つの主要な非翻訳領域にエンハンサー候補を配置する。目的の配列を増幅してベクターにクローニングするためのPCRプライマーを設計するには、ギブソンクローニング用の適切な相同性アームをプライマーの5つのプライムエンドに追加します。
設計したプライマーを用いて、DNAサンプルからPCRを行う。必要なクローニング反応の数に応じて、Pac1とAsc1を使用して1〜10マイクログラムのベクターDNAを消化します。0.7〜1%ゲル電気泳動を用いて、100ボルトで30〜60分間、制限ダイジェストフラグメントを分離します。
直鎖化ベクターのバンドを抽出し、市販のゲル抽出キットで精製します。ギブソンのクローニングと細胞の形質転換が完了したら、細胞を選択培地にプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。レポーター構築物のクローニングが成功したことを確認した後、グリセロールストックを使用して5ミリリットルのスターター培養液を接種します。
摂氏30度、毎分180回転の振とうインキュベーターで8〜16時間培養物を成長させます。ブロスが濁ったら、スターターカルチャーを250〜300ミリリットルの新鮮な選択的LBブロスで1, 000倍に希釈し、摂氏30度、毎分180回転で振とうインキュベーターで一晩インキュベートします。市販のプラスミドマキシキットを用いて、プラスミドを精製する。
ITRの再結合をテストするには、Xma1消化を実行します。バンドを視覚化します。ダイジェストに予想されるバンド数が表示されていることを確認します。
組み換えにより、バンドが予想よりも少なくなります。組換えAAV混合物を送達用に調製する。複数のエンハンサーレポーターウイルスの発現パターンを比較する場合は、各ウイルスを希釈して、ウイルス力価を最も濃度の低いウイルスと同等にします。
エンハンサーレポーターウイルスと構成的に発現したコントロールレポーターウイルスを2対1または3対1の比率で混合する。最終濃度0.06%の少量の高速緑色染料を追加しますマイクロリットル目盛り付きキャピラリーチューブから作られたプルドガラスピペットの先端を、繊細で糸くずの出ないワイプにそっと突き刺して壊します。マイクロキャピラリーピペットを保持するためのゴム製ガスケットに接続された圧力適用装置を備えたアスピレーターアセンブリにピペットを挿入します。
アスピレーターを通して負圧を加えることにより、約0.2〜0.5マイクロリットルの少量の鉱油をピペットに引き込みます。アスピレーターアセンブリを脇に置き、注入する準備ができるまでウイルスを氷の上に置きます。新生児マウスを凍結麻酔した後、アスピレーターアセンブリを使用して陰圧を加え、半月板が2マイクロリットルの目盛りを通過するまでウイルス混合物をプルドガラスピペットに引き込みます。
マウスをコールドチャンバーから離し、ベンチトップに置きます。ラムダとブレグマの中間にある両側注射部位、および矢状縫合糸と各眼を見つけます。アルコールワイプを使用してそれらを消毒します。
プルドグラスピペットを使用して新生児マウスの頭蓋骨に穴を開けます。針が頭蓋骨に入ったら、アスピレーターアセンブリを通して陽圧を加えます。1マイクロリットルのウイルスを側脳室に分注し、ピペットを引き出します。
マウスを加熱パッドまたは加温室に置いて回復します。目覚めたら、動物を家のケージに戻します。低倍率5倍の主観レンズを使用して脳切片を横断する蛍光画像を記録します。
注射部位を特定することにより、赤色蛍光細胞の密度と強度に応じて、ウイルス形質導入の程度を評価します。同様に形質転換された動物を比較します。25倍以上の高倍率対物レンズで蛍光画像を記録します。
次に、解析ソフトウェアを開き、3×3のメディアンフィルタを適用してノイズを低減します。[プロセス]メニューをクリックし、[ノイズ]をクリックして、[スペックル除去]オプションを選択します。次に、画像から背景蛍光を差し引くには、マルチチャンネル画像のチャンネルを分離することから始めます。
[画像]メニューをクリックし、[カラー]をクリックして、[チャンネルの分割]オプションを選択します。長方形または円の選択ツールを使用して、蛍光セルのない画像の領域に小さな形状を描画します。[分析]、[測定]の順にクリックして背景の平均ピクセル強度を測定し、繰り返して複数回サンプリングします。
5 から 8 の背景領域の平均グレー値を平均し、10 進値を削除します。「処理」メニューを選択して画像内の各ピクセルから値を減算し、「数学と減算」をクリックします。次に、減算する背景値を入力し、[OK] をクリックします。必要に応じて、画像メニューを選択してチャンネルをマルチチャンネル画像にマージし直し、「カラー」をクリックして、「チャンネルを結合」を選択します。
緑色蛍光細胞の数をカウントするには、緑色チャンネルを非表示にし、自由形状選択ツールを使用して赤色蛍光を発現する脳領域の周囲に形状を描画します。測定機能をクリックして、選択したゾーンの赤チャンネルの面積、積分密度、および平均グレー値を測定します。多点選択ツールを使用して緑色のセルの数をカウントし、赤色のチャネルの積分強度によって緑色のセルの数を正規化します。
マウスが陽性のAAV構築物と共にP0で頭蓋内注射したエンハンサーレポーターを形質導入した後、注射後28日目に皮質の中層下層でエンハンサー駆動EGFP発現を示した。P0に陰性対照コンストラクトを注射したマウスは、注射後28日目にEGFPの発現を示さず、エンハンサー要素がマウス脳におけるEGFPの転写を促進することが見出されたことを示している。形質導入に成功した領域と潜在的な変動性の制御を視覚化するために、異なる力価のAAV送達エンハンサーレポーターライブラリを調べました。
候補エンハンサーの高力価ライブラリは幅広いEGFP発現を促進し、候補エンハンサーの低力価ライブラリはP7マウス脳におけるまばらなCGFP発現を促進します。活性のないエンハンサーと失敗した送達を区別するために、すべての注射でエンハンサーレポーターAAVとポジティブコントロールを混合することが重要です。この手順は、免疫組織化学、RNA FISH、またはシングルセルRNAシーケンシングと組み合わせて、エンハンサーが活性である細胞タイプを決定することができます。
