網膜細胞のin vivoイメージングのこの方法は、眼科疾患の調査と網膜の正常な機能の理解を可能にします。この方法は、二光子顕微鏡による網膜のin vivoイメージングへの簡単で再現性の高いアプローチを提供します。マウスを適切に安定化させることは、高品質のin vivo画像を得るための鍵です。
マウスをヘッドホルダーにセットする練習をし、画像を取得する前に手順に慣れてください。承認された動物使用プロトコルに従って動物を鎮静させます。瞳孔拡張液を塗布し、マウスを暗所に5分間放置して、瞳孔を拡張させます。
下外耳道ピンを内側に伸ばした位置に固定し、上耳道ピンを引き出した位置に固定します。イヤピースバーが水平より60度の角度で傾くまで、ヘッドホルダーのメインアームを回転させます。マウスをバイトバーに向けて、片方の耳を伸ばした下部ピンに取り付け、ピンを外耳道に挿入します。
上外耳道ピンを固定しているネジを緩めた後、ピンをもう一方の外耳道に伸ばし、ネジを締め直してヘッドを固定します。マウスがヘッドホルダーにしっかりと固定されていることを確認してください。頭のてっぺんを押し下げます。
マウスはイヤーバーにしっかりと留まり、頭は外耳道の軸を中心に自由に回転する必要があります。バイトバーをマウスの頭に向けて、マウスの頭をそっと持ち上げて上顎切歯をバイトバーホルダーに下げ、バイトバーを穏やかな力で引っ込めて頭を固定します。ネジを使用してバイトバーを所定の位置に固定し、マウスとホルダーを顕微鏡ステージに置きます。
マウスの両目に潤滑剤点眼薬を塗布します。片方の目の瞳孔が光路に沿って向くまでヘッドホルダーのメインアームを回転させ、コンパクトなフィルターホルダーに番号1.5のカバーガラスを置きます。ホルダーを顕微鏡ステージに固定した後、角膜に触れずに潤滑剤アイジェルに接触するまでカバーガラスを下げ、広視野励起光が角膜を完全に覆うまでステージをX-Y寸法と対物レンズZ位置に調整します。
接眼レンズを使用して、網膜の蛍光細胞または構造に焦点が合うまでZ位置を調整し続け、必要に応じて落射蛍光照明器を増やして、関心のある個々の細胞または構造を分解します。網膜とイメージング光路のアライメントを微調整します。焦点面を変更するときに焦点が合っていない光の膨張または収縮のみが発生するまでヘッド角度を調整し、XY歪みを最小限に抑えます。
次に、落射蛍光イルミネーターをオフにし、イルミネーターのシャッターを閉じます。2光子イメージングの場合は、すべての機関のレーザー安全プロトコルに従ってください。すべての周囲光をオフにしてカバーし、励起光路をレーザーに切り替え、発光光路をPMTに切り替えます。
画像取得ソフトウェアで、フレームサイズを512 x 512に設定し、フレーム平均を3に設定します。Zステッピングをスタックの一番上から開始して下方向に進行するように設定し、光受容体の2光子レーザー活性化を最小限に抑えます。PMTをオンにして有効にし、電圧を680ボルトに調整します。
イメージングシャッターとエミッションシャッターを有効にします。1%のレーザー出力からターゲット組織のライブ画像プレビューを開始し、ディスプレイの明るさを自動調整して、目的の細胞または構造を視覚化します。ターゲット組織が薄暗いか不明瞭な場合は、45ミリワットを超えずに構造が見えるようになるまでレーザー出力のパーセンテージを増やします。
顕微鏡ステージをX-Y方向に操作して目的のイメージング領域を中心とし、関心のある構造に焦点を合わせたZ平面に移動します。慢性的なタイムラプス実験では、現在の画像のイメージング角度が前の画像の角度と類似していることに注意しながら、以前に取得した画像を開いて目的の細胞の参照として使用します。次に、対象Z平面の上位と最下位に移動して、イメージングスタックのZ制限を設定し、画像を取得します。
すべての画像が取り込まれたら、PMTとレーザーシャッターを無効にします。励起光経路を落射蛍光照明に切り替え、発光光路を接眼レンズに戻す。次に、画像取得ソフトウェアを終了し、コンピューターインターフェイスのレーザーをオフにし、常時オンの機器を除いて、逆の起動順序でハードウェアをシャットダウンします。
分析の最後に、マウスをヘッドホルダーから取り外し、糸くずの出ないティッシュを使用してアイジェルをそっと取り除きます。次に、潤滑剤の眼軟膏を両眼に塗布し、マウスを摂氏37度の温水循環加熱パッドに置き、完全に横臥するまで監視してから、マウスをハウジングに戻します。VGlut-2-Creマウスでは、網膜神経節細胞体細胞がはっきりと識別でき、軸索束がしばしば明らかになります。
軸索の軌跡と血管系のネガティブな画像は、VGlut-2-Creマウスの視神経乳頭の同定を容易にし、慢性イメージング実験のランドマークとして有用です。網膜神経節細胞とは対照的に、アマクリン細胞神経突起は内叢状層でより頻繁に観察される。眼内NMDA注射の1日後、網膜ミクログリアは以前の報告に従って短い突起またはアメーバ形態を示します。
イメージングの30〜60分前に腹腔内注射を1回行うエバンスブルー染料の送達は、視神経頭から発せられる血管の強力な標識を誘導し、少なくとも7日間持続します。.固定後、平坦化された網膜全体のマウント内の細胞ペア間の真の距離を共焦点スキャンで測定し、in vivoピクセル距離と照合して、in vivo画像の平均ピクセルサイズを決定できます。マウスの眼に注入された蛍光ミクロスフェアは、in vivoでのマイクロスフェア直径の測定を可能にし、わずかに大きいピクセルサイズの推定値を与えるが、より多くの分散を有する。
in vivoイメージングは、免疫染色やin situハイブリダイゼーションなどの組織学的分析と組み合わせることができます。これらの方法は、特定の細胞型を同定し、画像化された細胞の遺伝子発現を調べることができる。
