この手順のデモンストレーションは、大学院生のZhe Zhang、研究スペシャリストの南南張、イルカー・オズデン教授、シンフア・ディンです。この手順の全体的な目標は、遺伝子組み換えカルシウム指標、GCaMP5Gおよび6sを使用してイメージングのインビトロおよびインビボミトコンドリアカウントのための細胞型特異的な対アストロサイトとニューロンおよびミトコンドリアターゲティング方法を開発することです。インビトロまたはインビボイメージングでは、アストロサイトまたはニューロン特異的プロモーターgfaABC1DまたはCaMKIIおよび遺伝子組み換えカルシウム指標であるGCaMP5G/6sをミトコンドリア標的配列で含むDNAプラスミドを構築します。
インビトロミトコンドリアカルシウムイメージングでは、リポフェクタミン法を用いて前述のDNAプラスミドを用いてガラスカバースリップで培養したアストロサイトニューロンをトランスフェクトしました。画像化は、蛍光または2光子顕微鏡下でガラスカバースリップを拡散室に移すことによって、トランスフェクションの1〜2日後に開始することができる。左側にGCaMP6sを発現するミトコンドリアやアストロサイトからの蛍光シグナルの例を、右側にGCaMP5Gを発現するニューロンのミトコンドリアについて紹介します。
インビボイメージングでは、細胞内のミト-GCaMP6s発現に対する細胞-GCaMP5Gおよび血清型9の発現に関連するアデノウイルスに関連する血清型5を用意した。立体ウイルス注射手術では、まず3%イオブルランでマウスを麻酔しました。手術の後、イオブルランレベルは、麻酔の適切なレベルに達した後に2%に減少し、頭皮の上の毛髪を剃り、マウスは立体性外科手術器具に配置されます。
眼科軟膏は、手術中にそれらを保護するために目に適用されます。注射手術は無菌の器械および無菌の技術を含む無菌のプロシージャを使用して行われる。手術器具は、オートクレーブまたはホットビーズ滅菌装置によって滅菌されます。
マウスを立体税に取り付けた後、頭皮をベタジンと70%エタノールで3回洗浄します。その後、皮膚はブレグマラムダ軸に沿って切り開き、垂直はターゲットの位置上の高速ドリルによって行われます。本研究では、運動皮質またはパラコルテックスのいずれかを対象とした。
関連するアデノウイルスベクターを運ぶ33ゲージのハミルトン注射器が脳に穴を通して挿入され、標的領域にベクターが注入される。皮質分娩のために、我々は複数のステップで2つの深さでウイルス溶液を注入する。まず、針を1ミリメートル深く皮質に挿入します。
脳が回復するまで5分を許した後、針を700マイクロメートルの深さまで動かし、500ナノリットルのウイルス溶液を注入します。注射が完了した後、ウイルスが脳内で拡散できるように5分待ちます。そして、針を深さ300マイクロメートルの2番目の注射位置まで移動します。
ここでは、さらに500ナノリットルのウイルス溶液を注入します。注射が完了した後、ウイルスが拡散するのを10分間待ってから、脳から針を取り除き、骨ワックスまたはKwik-Silでバリ穴を閉じます。最後に、皮膚はVetbondで縫合され、マウスは動物施設に送り返される前に加熱パッドで回収される。
マウスは、GCaMP発現が成熟する期間である、最低3週間でインビボイメージングに使用する準備が整います。頭蓋窓の注入の外科は注入の外科のために記述されるように無菌条件を使用してまた行われる。頭蓋窓の外科的処置は、頭蓋骨暴露の時点まで注射外科手術と同一である。
頭蓋骨が露出すると、ウイルス注入領域上の直径2〜3mmの開頭術の四分の一は、マニピュレータに取り付けられた高速ドリルによって作られた4つの浅い穴でマークされます。その後、頭蓋骨のセクションは、頭蓋骨切開術の峡谷で、これらの4つの穴を結び、円の中で骨を慎重かつゆっくりと掘削することによって薄くなる。国境の頭蓋骨が十分に薄い場合、骨は鋭いピンセットで持ち上げられ、取り除かれます。
露出した硬膜は頭蓋窓の注入のために取除くか、またはそのまま保つことができる。頭蓋窓は直径3~5ミリのガラスカバースリップで構成され、中心に約300ミクロンの厚さのシリコーンディスクが作成されています。頭蓋窓の取り付けは、頭蓋骨の上に置くことによって達成される。
マニピュレータに取り付けられた爪楊枝の一部は、頭蓋窓を脳の表面にそっと押し込むために使用されます。次いで、頭蓋窓の縁部を少量のシリコーン接着剤Kwik-Silで密封する。最後に、頭蓋の窓は、歯科アクリルで頭蓋骨の縁に固定されています。
強い結合のために頭蓋窓の端にわずかに歯科用アクリルを適用するためのケアを与える必要があります。他の多くの研究グループが過去に実施したように、1.2%のアガロースゲルをシリコンディスクの代替としてカバーガラスと脳の間で使用することができます。頭蓋窓がしっかりと取り付けられた後、頭蓋骨に金属板が取り付けられます。
このヘッドプレートは、イメージングセッション中に2光子顕微鏡のステージ上でマウスの頭部を固定するために使用されます。アストロサイトにおけるミトコンドリアカルシウム取り込みはATDの適用によって引き出され、ニューロンのミトコンドリアカルシウム取り込みは、灌流系を介した重力を伴う人工脳脊髄液中のグルタミン酸グリシン用途によって引き出すことができる。その後、アストロサイトおよびニューロンにおける個々のミトコンドリアにおけるカルシウム取り込みは観察され得る。
以下の映画は、左のATPによって引き出されるアストロサイトと、右のグルタミン酸とグリシンによって引き出されるニューロンにおけるミトコンドリアカルシウム取り込みについて示しています。イメージングは、コヒーレントから100万台のTiサファイアウルトラレーザーを搭載したプレーリーテクノロジーズのウルティマ2光子顕微鏡システムを備えたアストロサイトおよびニューロンのミトコンドリア蛍光シグナルの時間経過2光子画像を収集することによって行われます。880~910ナノメートルの励起波長を使用しており、GCaMP5Gや6sでのインビボイメージングに最適です。
有限体細胞およびマイト-GCaMP5Gおよび6sのニューロン特異的発現と、SR101またはニューロン特異的マーカーNeuNのアストロサイト特異的標識の共局在化により再確認した。生体内のアストロサイトおよびニューロンにおける自発的なミトコンドリアカルシウム取り込みは、2光子顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングによって観察することができる。画像は、左のアストロサイトと右側のニューロンの個々のミトコンドリアで自発的なカルシウムの増加を示しています。
我々のアプローチは、細胞型特異的ミトコンドリアカルシウムイメージングインビトロおよびインビボに有用である。このビデオを見た後, あなたは、アストロサイトとニューロンでミトコンドリアカルシウムの取り込みを画像化する方法をよく理解している必要があります。.
