この手法は、ニューロンにおけるカルシウムの取り扱い、および区画化されたカルシウムがin vivoのニューロン機能に重要なさまざまなメカニズムをどのように制御できるかについての理解を深めるために使用できます。この技術の主な利点は、他の蛍光ツールと組み合わせることができるC.elegansの生理学的条件下で、より高い解像度の迅速なin vivoイメージングを可能にすることです。この手法は、さまざまな状況でニューロンのカルシウムシグナル伝達を調節するメカニズムに関する洞察を提供する可能性があります。
例えば、老化中、神経損傷、および神経変性の間。この手順を実演するのは、研究技術者のエニス・ダイルです。博士課程の候補者であるカズ・ナイトと、私の研究室のポスドク研究員であるレイチェル・ドーザー。
まず、プロモーター、カルシウムインジケーター、および選択した3つのプライムUTRを含む発現ベクターをクローニングします。カルシウムインジケーター導入遺伝子にレスキューDNA Lin-15プラスを含むDNAミックスを1日齢の成人C.エレガンスの生殖腺にマイクロインジェクションすることにより、トランスジェニックC.elegans株を作成します。F20の子孫が成体に達するまで、注入された親ワームを摂氏1度に維持します。
多外陰部の表現型がないことをスクリーニングすることにより、トランスジェニック成人を選択します。すなわち、カルシウム指示薬を含む外染色体配列の発現を示す。クローン継代成体F1は、多外陰部表現型を持たない。
カルシウム指示薬の最適な発現を有するトランスジェニック株のその後の世代について実験を行う。長期間のタイムラプス撮影が可能な顕微鏡を使用してください。低倍率の対物レンズの下にワームを配置し、高倍率の対物レンズに切り替えてニューロンを局在化させます。
50FPS以上の高速画像取得が可能な超高感度カメラを使用して画像を取得します。次に、カルシウムインジケーターに標準の発光フィルターを使用します。10秒を超える画像ストリームを取得するためのZドリフト補正器を追加します。
13×100mmのガラス培養チューブに、分子グレード寒天をM9に溶解し、数秒間マイクロ波で3ミリリットルの10%寒天を調製します。寒天パッドを作るには、まず、2層の実験用テープを追加して2枚のスライドを準備します。次に、2つのスライドの間に顕微鏡スライドを配置します。
1000マイクロリットルのピペットチップの先端を切り取り、それを使用してカバースリップの中央に寒天の小さな滴をピペットで貼り付けます。寒天の上に別のスライドを押し下げて、寒天を平らにします。冷却後、10ミリリットルのチューブの開口部を使用して寒天を小さなディスクに切断し、周囲の寒天を取り除きます。
次に、ムシモール粉末をM9に溶解してウォーム圧延液を調製し、30ミリモルのストックを作成した。ストックをポリスチレンビーズで1対1の比率で希釈して、圧延溶液を作ります。ワームをイメージング用に配置するには、まず、1.6マイクロリットルのローリング溶液を寒天パッドの中央に置きます。
次いで、好ましいワームピックを用いて、所望の年齢のワームを寒天パッド上の転動溶液に移す。ムシモールがワームの動きを減らすまで約5分間待ってから、寒天パッドの上に22 x 22ミリメートルのカバースリップを落とします。腹側神経索の神経突起を画像化するには、カバースリップをわずかにスライドさせてワームを転がします。
ワームを顕微鏡に取り付けるには、カバースリップに液浸オイルを一滴置きます。明視野で低倍率の対物レンズを使用してワームを見つけます。次に、100倍の対物レンズに切り替え、GCaMPまたはmito GCaMPの照明と488ナノメートルのイメージングレーザーを使用してAVA神経突起を見つけます。
in vivo GCaMPイメージングの場合は、バジルGCaMP蛍光がカメラのダイナミックレンジのミッドレンジに入るまで、取得設定でイメージングレーザーを調整し、露光時間を20ミリ秒に設定します。GCaMP蛍光を100倍の倍率で使用してAVA神経突起を見つけた後、Zドリフト補正器を設定し、連続オートフォーカスを開始します。イメージングする前に、必要に応じて焦点面を手動で修正します。
100倍の倍率で画像のストリームを取得します。このプロトコルを使用して、細胞質カルシウムを高い時間的および空間的分解能で測定しました。グルタミン酸作動性AVAコマンド介在ニューロンにおけるGCaMP6Fの細胞特異的発現は、カルシウム流入の方向性伝播を明らかにした。
GCaMP6F蛍光の細胞内定量は、わずか10マイクロメートル離れた神経突起の一部でカルシウム流入の開始が遅れることを示しました。また、AVA神経突起に沿って見られる樹状突起スパイン様構造は、神経突起の活性化とは無関係に起こり、カルシウム流入の伝播をもたらさないGCaMP6F蛍光の閃光を示した。また、ミトコンドリアマトリックス局在カルシウム指標mito GCaMPのAVA特異的発現を有する虫株を用いて、個々のミトコンドリアにおける単一神経突起における相対カルシウムレベルを測定した。
結果は、ミトコンドリアのサブセットへの比較的大量のカルシウムの同期取り込みを示しました。具体的には、一部のミトコンドリアへのカルシウム取り込みは同期していたが、隣接するミトコンドリアはカルシウムを吸収していないようであった。同様に、ミトコンドリアのサブセットは、少量のカルシウムの急速な取り込みと放出を示しました。
これも同期しているように見えましたが、ミトコンドリアのサブセットに対してのみです。スピードと細かい操作は、動物のポジショニングと神経機能の維持に不可欠です。動物の健康も最優先事項です。
少しでも飢餓は問題があります。学ぶのが最も難しい部分は、損傷のない共焦点顕微鏡検査のための動物の迅速な配向です。私のアドバイスは、多くの練習と良いコントロールです。
このプロトコルは、カルシウムがニューロンの他の細胞内位置、他のニューロン、またはC.elegansのニューロン以外の細胞から放出される実験に適用できます。C.elegansのこのアプローチは動物を無傷のままにするので、完全な神経系の単一ニューロンにおけるin vivoでの細胞内カルシウム取り扱いの調節に関する質問に取り組むことが可能です。
