ご説明のMEA 4-AP脊髄スライス調製物は、背角回路の接続性および脊髄感覚処理中にこれらのネットワークがどのように相互作用するかを研究するためのプラットフォームを提供します。提示された方法論は、背側角回路の活動を巨視的な領域レベルの分解能で調査することを可能にする。この調製物は、脊髄感覚回路におけるシグナル伝達を破壊する化合物の能力を評価するための迅速なスクリーニングツールとして使用することができる。
この方法は、特定の細胞型および小さな微小回路の活動がニューロンの大規模な集団にどのように影響し、その後、背角行動応答の出力、そして最終的には痛みの経験を形成するかについての理解のギャップを埋めるのに役立ちます。まず、MEAを馬血清で30分間よく満たします。血清を除去した後、蒸留水が非発泡になるまでMEAを蒸留水で5回十分にすすいでください。
その後、ウェルを人工CSFで満たします。麻酔をかけたマウスを断頭した後、腰の高さで皮膚に小さな切り込みを入れて、腹部の上の皮膚を除去します。次に、すべての皮膚が胸郭の上部から骨盤の上部まで、腹側および背側の両方で除去されるまで、切り込みの両側の皮膚を吻方向に引っ張る。
体を氷の上に置いた後、腹側アプローチを使用して、内臓を取り外し、肋骨を横方向に胸骨まで切断して、椎骨柱を露出させます。腹側胸郭、肩甲骨の両方、および下肢および骨盤を取り外す。椎骨柱および肋骨標品を氷冷スクロース人工CSFを含む解剖浴に移す。
下背筋と付属の上肋骨にピンを配置して、準備の4つの角をすべて固定します。椎骨の腹側表面を覆っているすべての筋肉および結合組織をロンガーで取り除き、T12-L2椎体のほぼ下にある腰 - 仙骨拡大の上の椎体領域を特定する。椎体尾部を腰 - 仙骨拡大領域に除去して、椎骨管に座っている脊髄にアクセスする。
湾曲したスプリングはさみを使用して、椎骨の腹側と背側の側面を分離し、脊髄を露出させるために、椎体を吻側に持ち上げて引っ張りながら、椎体椎弓根を両側に切断する。椎体が取り除かれて腰 - 仙骨の拡大が現れたら、コードが自由に浮かぶまで、脊髄を固定する残りの根をスプリングハサミで慎重に取り除きます。腰 - 仙骨の拡大の上下に吻側および尾側の切り込みで脊髄を分離し、コードの標的領域が自由に浮かぶようにする。
横方向のスライスの場合は、中央に浅いチャネルカットが施されたプレカットポリスチレンブロック上に、腰部 - 仙骨セグメントを取り付けたルートで持ち上げて配置します。次に、シアノアクリレート接着剤を使用してブロックとコードをセクショニングプラットフォームに取り付け、氷冷スクロース人工CSFスラリーを含む切断浴に入れます。厚さ300マイクロメートルのスライスが得られたら、スライスを酸素化人工CSFを含む空気界面インキュベーションチャンバに移し、スライスを室温で1時間平衡化させる。
背側ホーン活動の記録を開始するには、人工CSFで満たされた大きなチップパスツールピペットを使用して、スライスをインキュベーターからMEAウェルに移し、追加の人工CSFを追加します。細かい短いヘアペイントブラシを使用して、スライスを60電極記録アレイの上に置きます。次に、組織の上に加重首を置き、所定の位置に保持し、MEA電極との良好な接触を促進します。
MEA を記録ヘッドステージに配置します。倒立顕微鏡を使用して電極上の組織の位置を確認し、できるだけ多くの電極が表層DHの下にあることを確認します。少なくとも 2 ~ 6 個の電極がスライスに接触していないことを確認します。カメラをデバイスに接続した後、解析中に使用するために、MEAを基準としたスライスの基準画像を撮影します。
次に、記録ソフトウェアのスタートDAQを押し、すべての電極がクリア信号を受信することを確認します。次に、灌流入口と出口のラインを人工CSFで満たされたMEAウェルに取り付け、灌流システムをオンにします。流量を確認し、流出がスーパーフューセートのオーバーフローを防ぐのに十分であることを確認してください。
組織を5分間平衡化した後、生のベースラインデータを5分間記録する。灌流入口ラインを人工CSFから4-アミノピリジン溶液に移動し、4-アミノピリジン誘発リズミカル活性が定常状態に達するまで12分間待つ。次いで、4−アミノピリジン誘導活性の5分間を記録し、薬物を試験するか、または4−アミノピリジンの安定性をチェックするために、その後の記録のために準備される。
各記録セッションに続いて、人工CSFでラインをすすぎます。MEAをヘッドステージから取り出し、MEAウェルからネットと組織を取り除いた後、MEAとネットを人工CSFですすぎ、新しいスライスでプロセス全体を繰り返す。解析ソフトウェアを開き、あらかじめ作成された解析レイアウトをロードします。
目的のファイルを開き、参照電極と、ノイズが多すぎると見なされる電極の選択を解除します。分析のタイム ウィンドウを設定します。次に、クロスチャンネルフィルタータブに移動します。
実験中に撮影した画像とメモに基づいて複雑な参照電極と参照電極を選択し、続行する前に[探索]を押します。「EAP フィルター」タブに移動し、2 次ハイパス・バターワース・フィルターを適用して LFP アクティビティーを除去します。LFP フィルター タブに移動し、2 次バンド パス バターワース フィルターを適用して EAP アクティビティを削除します。
EAP 検出器タブで、自動しきい値を選択し、立ち上がりエッジと立ち下がりエッジのボックスにチェックを入れ、デッドタイムを 3 ミリ秒に設定してください。正と負のしきい値を設定するには、生データ アナライザー画面に戻り、タイム マーカーを移動して EAP 検出器タブに戻り、探索を押して、データを検査します。設定された検出しきい値がノイズや非生理学的活性をキャプチャせずにEAPをキャプチャするまで、このプロセスを繰り返します。
LFP検出器タブで、手動しきい値を選択し、立ち上がりエッジと立ち下がりエッジボックスにチェックを入れ、デッドタイムを3ミリ秒に設定してください。1 つの電極にしきい値を設定し、満たされたら、[すべてに適用] を選択し、[解析の開始] を押します。電圧ゲートナトリウムチャネルアンタゴニストテトロドトキシンの浴中適用は、EAPおよびLFP活性の両方を消失させ、これらのシグナルのスパイク依存性を確認した。
4−アミノピリジン誘導活性パラメータの安定性を、EAPまたはLFPについて特徴付けた。すべての活性特性にLFPに対する活性の一致を加えたものは、4-アミノピリジン適用後12分および15分後における4-アミノピリジン誘導活性の類似性に基づいて安定していた。この機能のEAPまたはLFPは、複数の電極にわたって検出された一致イベントの数の増加によって特徴付けられました。
連結された隣接電極の数、および4−アミノピリジン刺激後の隣接電極とLFPsとの間の結合の強さ、次いで相対的安定性。スライスの向きは、in vitro製剤にとって重要な考慮事項です。4−アミノピリジン刺激は、スライス配向に関係なくSDHにおいて同様のリズミカル活性を誘導した。
最後に、DHネットワークの4-アミノピリジン活性化の関連性にさらなる光を当てるために、上昇したカリウム人工CSF溶液を浴適用し、4-アミノピリジン刺激に対する同様のDH応答を喚起することを示した。プロトコルの重要なステップは、組織の準備と切片の配置にあり、慎重だがタイムリーな解剖、およびMEA上の組織の繊細な最適な位置決めを通じて組織が健康であることを保証することは、質の高い結果を得るのに役立ちます。
